1 ESPIROQUETAS Microbiología Médica I Tema 16 Treponema BorreliaUNIVERSIDAD CENTROOCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO” DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SOCIAL SECCION DE MICROBIOLOGÍA Microbiología Médica I Tema 16 Treponema ESPIROQUETAS Borrelia Leptospira Lic. Yudy Aranguren Septiembre 2009

2 UNIDAD 9: BACTERIAS ESPIRALADASTEMA 16: ESPIROQUETAS Explicar las características biológicas, morfológicas, ultraestructurales y factores de virulencia de las espiroquetas. Diferenciar a los géneros Treponema, Borrelia y Leptospira por sus características biológicas, antigénicas, tinciones u otras técnicas de visualización. Ordenar los pasos para la identificación de grupos y subgrupos taxonómicos de las especies de importancia médica del género Leptospira. Ordenar los pasos para la identificación los pasos para la identificación en el laboratorio de las especies de importancia médica de los géneros Treponema y Borrelia.

3 Treponema pallidum subespecie pallidum TAXONOMIA- PATOGENOS ORDEN: SPIROCHAETALES FAMILIAS SPIROCHAETACEAE LEPTOSPIRACEAE GÉNEROS BORRELIA TREPONEMA LEPTOSPIRA ESPECIES Treponema pallidum subespecie pallidum Treponema pallidum subespecie pertenue Treponema pallidum subespecie endemicum Treponema carateum Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Borrelia spp. Leptospira interrogans Leptospira biflexa Leptospira spp. > 17 especies

4 CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES:ESPIROQUETAS CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES: FORMA DE LA CÉLULA: Bacilos largos y delgados en forma helicoidal formando una espira Treponema Cuerpo celular flexible Borrelia Células individuales Leptospira

5 ESPIROQUETAS TIPO DE PARED: No se tiñen con la coloración de Gram Pared tipo Gram negativa Fina capa de peptidoglicano: Forma Flexibilidad

6 ESPIROQUETAS FLAGELO: Endoflagelo, fibras axiales o flagelo periplasmático 1.- Número de fibras axiales varía entre los géneros: 2 y 200 fibras axilales: Treponemas: 6 Borrelias: Leptospiras: 2 2.- Permite los característicos movimientos tipo: Rotación Flexión Tirabuzón o sacacorcho 3.- Quimiotáxis

7 ESPIROQUETAS FLAGELO:3.- Rodea al cilindro protoplasmático, colocado en el espacio periplasmático, entre la membrana interna y la membrana externa también llamada: Envoltura externa o vaina ENDOFLAGELOS O FIBRAS AXIALES MEMBRANA EXTERNA CILINDRO PROTOPLASMATICO MEMBRANA INTERNA y CAPA DE PEPTIDOGLICANO

8 ESPIROQUETAS Las fibras axiales (endoflagelos) se insertan en los polos de la célula y se solapan en la región central. Membrana externa Fibras axiales o flagelo Espacio periplasmático Capa de peptidoglicano Membrana citoplasmática o membrana interna J Bacteriol October; 88(4): 1087–1103.

9 MEMBRANA CITOPLASMÁTICA O MEMBRANA INTERNAUltraestructura de una espiroqueta: Corte transversal CILINDRO PROTOPLASMÁTICO CAPA DE PEPTIDOGLICANO MEMBRANA EXTERNA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA O MEMBRANA INTERNA FIBRAS AXIALES NUCLEOIDE RIBOSOMAS ESPACIO PERIPLASMÁTICO

10 ESPIROQUETAS CILINDRO PROTOPLASMÁTICO MEMBRANA EXTERNA FIBRAS AXIALES

11 ESPIROQUETAS MEMBRANA EXTERNA CILINDRO PROTOPLASMÁTICO

12 Tolerancia de O2 : Van desde aerobios a anaerobios estrictosESPIROQUETAS FISIOLOGIA y HÁBITAT: Tolerancia de O2 : Van desde aerobios a anaerobios estrictos Fermentan y oxidan azucares y aminoácidos Hábitat: Vida libre en ambientes ricos en materia orgánica Saprófitos Patógenos

13 GÉNERO TREPONEMA

14 Treponema pallidum subespecie pallidum TAXONOMIA ORDEN: SPIROCHAETALES FAMILIAS SPIROCHAETACEAE LEPTOSPIRACEAE GÉNEROS BORRELIA TREPONEMA LEPTOSPIRA ESPECIES Treponema pallidum subespecie pallidum Treponema pallidum subespecie pertenue Treponema pallidum subespecie endemicum Treponema carateum Sífilis Frambesia Bejel o Sífilis endémica Pinta o Mal de Pinto

15 Enfermedades asociadasSífilis Enfermedades asociadas Bejel Frambesia Pinta o Mal de Pinto

16 CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LOS TREPONEMAS:Forma: Espiroquetas de forma helicoidal con espiras muy cercanas y con extremos rectos Tamaño: Ancho: 0,1 – 0,2 µm Largo: µm Espiras regulares con separaciones de 1 µm Flagelos: Tres pares de endoflagelos Especie tipo: Treponema pallidum

17 Envoltura mucosa de glucosaminoglucanoTREPONEMAS Corte transversal y longitudinal de Treponema pallidum Envoltura mucosa de glucosaminoglucano

18 HABITAT: Saprófítos: Especies de vida libre (3 especies) Flora normal en humanos: Placa dental, intestinos y genitales. Patógena: Piel y secreciones genitales CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS Flora normal y saprófítos: Anaerobios Facultativos Treponema pallidum: microaerófilo (1 – 4 % O2 ) Treponema pallidum: No se ha podido cultivar en medios artificiales Cultivos cortos en cultivos celulares (epitelio de conejo) Inoculación en testículos de conejos. Especies no patógenas: cultivo de tejido Sensibilidad: Calor y desecación Compuestos con arsénico, mercurio y bismuto

19 CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS Treponema pallidum: Membrana externa: TREPONEMAS CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS Treponema pallidum: Membrana externa: No tiene Lipopolisacáridos Posee proteínas unidas a lípidos que las aísla del contacto con Ac Cardiolipina: Componente lipídico de la membrana externa Antígeno utilizado en las pruebas NO TREPONEMICAS de la Sífilis Proteínas de membrana inducen Ac específicos para pruebas TREPONEMICAS basadas en IFI y Microhemaglutinación

20 FACTORES DE VIRULENCIA:TREPONEMAS FACTORES DE VIRULENCIA: 1.- Presencia de proteínas de la membrana externa: Adhesinas Activan la respuesta inmune generando lesiones al paciente No tiene Lipopolisacáridos (LPS) 2.- Hialuronidasa: Favorece la invasión de los tejidos vasculares 3.- Produce Fibronectina: Mimetiza a la célula hospedera evadiendo la fagocitocis. 4.- Capa mucoide: Efecto antifagocitario Inhibe el contacto con los Anticuerpos CAPA MUCOIDE

21 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIOTREPONEMAS MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIO 1.- Exámen directo de secreciones de las lesiones: No se tiñen con Gram o Giemsa 1.- Observación directa al fresco en microscópico de Campo oscuro

22 2.- Tinciones de Plata (argénticas): Fontana - TribondeauTREPONEMAS 2.- Tinciones de Plata (argénticas): Fontana - Tribondeau 3.- Inmunofluorescencia directa 2.- PCR: Determinación de fragmentos específicos del genoma de los treponemas

23 GÉNERO BORRELIA

24 Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Borrelia sp. TAXONOMIAORDEN: SPIROCHAETALES FAMILIAS SPIROCHAETACEAE LEPTOSPIRACEAE TREPONEMA LEPTOSPIRA GÉNEROS BORRELIA Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Borrelia sp. ESPECIES Enfermedad de Lyme Fiebre recurrente epidémico Fiebre recurrente endémico

25 Enfermedades asociadasFiebre recurrente Enfermedad de Lyme

26 CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LAS BORRELIAS:Largas varillas arrolladas helicoidalmente: Ancho: 0,2 a 0,5 µm Largo: 8 a 30 µm Pocas espiras, laxas e irregulares con separaciones de 2-4 µm Endoflagelos: 7 – 20 fibras axiales Imparte motilidad por flexión o rotación Se tiñen bien con anilinas: Giemsa o Wrigth Pared celular tipo Gram negativo

27 LAS BORRELIAS HABITAT: Se mantienen en la naturaleza en mamíferos silvestre y artrópodos que sirven de vectores: Piojos Garrapatas Requerimientos nutricionales muy complejos Difícil cultivo en el laboratorio Medios líquidos con sangre o suero CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS Microaerófilos Resistencia: Sobreviven a 4°C durante meses

28 CARACTERISTICAS ANTIGÉNICASLAS BORRELIAS CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS Borrelia recurentis: Variación antigénica durante la infección mediante reordenamiento genético de las proteínas de membrana externa. Enfermedad Recaída Recaída Días Antígeno 1 Antígeno 2 Antígeno 3 Antícuerpo 1 Antícuerpo 2 Antícuerpo 3

29 LAS BORRELIAS FACTORES DE VIRULENCIA: 1.- No producen exotoxinas 2.- Lipopolisacaridos de la membrana externa como ENDOTOXINA: Induce la fiebre 3.- La Borrelia burgdorferi presenta moléculas de superficie que capturan e inactivan la fracción C3 del complemento Evasión del Sistema de Complemento

30 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIOBorrelia recurentis: 1.- Exámen directo: Extensiones sanguíneas teñidas con Giemsa o Wright. Borrelia borgdorferi 1.- Exámen directo: Inmunofluorescencia directa 2.- Aislamiento de muestras de pacientes: Cultivo en medios líquidos como el: Barbour-Stoenner-Kelly (BSK II) Crecimiento lento (Inútil para Dx) Requerimientos nutricionales muy complejos 3.- PCR: Determinación de fragmentos específicos del genoma de las borrelias

31 GÉNERO LEPTOSPIRA

32 *sensu lato: En sentido amplioTAXONOMIA ORDEN: SPIROCHAETALES FAMILIAS SPIROCHAETACEAE LEPTOSPIRACEAE GÉNEROS BORRELIA TREPONEMA LEPTOSPIRA LEPTONEMA TURNERIELA ESPECIES ESPECIES PATÓGENAS Leptospira interrogans sensu lato* Leptospira biflexa sensu lato Leptospira spp. > 17 especies ESPECIES NO PATÓGENAS *sensu lato: En sentido amplio

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34 CARACTERÍSTICAS GENERALES LEPTOSPIRAS:Espiroquetas enrolladas con espiras numerosas y muy apretadas Tamaño: Ancho: 0,1 – 0,3 µm Largo: µm Extremidades en gancho

35 LEPTOSPIRAS FLAGELO: Endoflagelo, fibras axiales o flagelo periplasmático 1.- Número de fibras axiales: 2 2.- Permite los característicos movimientos tipo: Rotación Flexión Tirabuzón o sacacorcho 3.- Quimiotáxis: Las leptospiras tienen un número mayor de genes que codifican para proteínas de motilidad y quimiotáxis que las Borrelias y los Treponemas.

36 LEPTOSPIRAS Número de cromosomas: 2 Sensibilidad: Desecación Luz solarPierden viabilidad a pH ácido: 6.8 Cloro y detergentes Resistencia: Mantienen viables a agua por varios días a pH alcalino Liofilización -70° C

37 LEPTOSPIRAS HABITAT: Saprófitas o de vida libre: aguas limpias y estancadas. Soportan cierto nivel de salinidad. Patógenas: Tiene como huésped a diversos tipos de mamíferos, reptiles, anfibios. CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS Requerimientos nutricionales complejos: Suplemento de albúmina bovina o suero de conejo Fuente de carbono y energía: Ácido graso de cadena larga Fuente de nitrógeno: Sales de amonio Cultivo en el laboratorio: Medios semisólidos: EMHJ, Fletcher o Stuart Incubación entre 28 a 30 °C Crecimiento lento: 18 horas como tiempo de generación Aerobios obligados

38 LEPTOSPIRAS FACTORES DE VIRULENCIA: 1.- No producen exotoxinas 2.- Lipopolisacaridos de la membrana externa como ENDOTOXINA: 3.- Produce dos hemolisinas: Lipoproteínas de la membrana externa Fosfolipasa Esfingomielinasa 5.- Hialuronidasa: Favorece la invasión de los tejidos vasculares

39 CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS: Estructura antigénica compleja LEPTOSPIRAS CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS: Estructura antigénica compleja Base de la clasificación clásica del género Leptospira Leptospira interrogans sensu lato Leptospira biflexa sensu lato ESPECIES PATÓGENAS ESPECIES NO PATÓGENAS Lipopolisacaridos (LPS) determinan las características antigénica de cada grupo: Serogrupo: Grupo de serovares con antígenos comunes Serovar: Unidad básica taxonómica

40 LEPTOSPIRAS MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIO 1.- EXÁMEN DIRECTO 1.- Observación directa al fresco en microscópico de Campo oscuro 2.- Tinciones de Plata: Fontana modificado 3.- Inmunofluorescencia

41 LEPTOSPIRAS 2.- CULTIVO: Medios especiales: EMJH, Fletcher o Stuart Aisla de sangre, LCR, orina Crecen con lentitud: Tiempo de generación: 18 horas Aerobios Requieren incubación a 28 – 30 °C durante hasta 6 semanas. Cultivos puros: 1 semana 3.- PCR: Determinación de fragmentos específicos del genoma de las Leptospiras

42 CUADRO COMPARATIVO DE LOS GÉNERO DE ESPIROQUETASCARACTERISTICAS TREPONEMA BORRELIA LEPTOSPIRA ESPECIES DE IMPORTANCIA MÉDICA CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS HABITAT CARACTERISTICAS METABÓLICAS FACTORES DE VIRULENCIA CARACTERISTICAS ANTIGÉNICAS MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN POR TINCION MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN POR CULTIVO