1 Esterilización – Cinética de Esterilización La esterilización es el proceso de conseguir la esterilidad, en la que no existen grados; un objeto, superficie o sustancia es, o no es, estéril. Si es estéril no contiene organismos viables o células presentes y si se le protege contra la contaminación, la condición estéril permanecerá indefinidamente. La desinfección implica que el material ha sido tratado a fin de eliminar o reducir el riesgo de organismos patógenos, pero no implica que todos los organismos viables hayan sido inactivados. Los procedimientos de esterilización se aplican para: (1)asegurar que un proceso o experimento sea llevado a cabo solamente con el organismo deseado. (2)permitir la utilización segura de los productos. (3)evitar contaminación ambiental. (4)impedir el deterioro de un producto. La esterilización se lleva a cabo o bien eliminando los organismos viables, como en la filtración, o matándolos de una de las siguientes formas:

2 (1)calentando en presencia o ausencia de agua. (2)irradiando con radiaciones ultravioleta, gamma o rayos X. (3)tratando con productos químicos en solución o en forma gaseosa. La elección del agente depende de las circunstancias, servicios existentes, naturaleza del material o equipo que ha de ser esterilizado, y el costo. Resistencia a la esterilización Las esporas bacterianas son las células vivas conocidas más resistentes al calor y la esterilización debe ser capaz de eliminar las esporas más resistentes de las especies más resistentes. Se ha descripto que las esporas de las bacterias termófilas sobreviven el vapor de agua a presión (200 kPa o 30 psi) a 134 ºC de 1 a 10 minutos, y el calor seco a 180 º C durante al menos 15 minutos. La resistencia de las esporas individuales dentro de una población varía, y cuanto mayor sea la población, mayor es el número de esporas individuales más resistentes. La resis­tencia de las esporas será afectada también por las condiciones de esporulación, condiciones de almacenamiento y edad, así como por las condiciones durante y después del

3 calentamiento. Mecanismos de muerte Calentamiento La muerte de una espora es necesaria solamente para desnaturalizar irreversiblemente todas las moléculas de cualquier enzima que sea esencial para la germinación o el crecimiento, o alternativamente para dañar irreversiblemente el gen pa­ra una enzima esencial. El calentamiento causa la ruptura del DNA pero la asociación protectora entre el DNA y el dipicolinato cálcico de la espora bacteriana hace más probable que el daño letal en la esterilización por calor implique la inactivación de proteínas. La resistencia de las proteínas al calor es una función de su hidratación, y cuanto mayor sea la cantidad de agua, más fácilmente entrará en los dominios hidrofóbicos internos de las moléculas de proteínas causando un cambio irreversible en su conformación. Las estimaciones del contenido en agua de las esporas varían en el rango de aproximadamente 5-20 %. En la esterilización húmeda el vapor a presión tiene dos funciones importantes: (1)condensándose sobre el material que va a ser esterilizado permite que elcalor se transfiera rápidamente causando un aumento rápido de la tem­peratura (2)) las propias moléculas de agua aumentan, o al menos mantienen el nivelde hidratación dentro de la espora.

4 En la esterilización con calor seco el calor es transferido muy lentamente y la tendencia es reducir más el nivel de hidratación y de esta forma proteger las proteí­nas de las esporas; las esporas son considerablemente más resistentes al calor seto que al calor húmedo. Radiación La irradiación mediante luz ultravioleta de longitud de onda 250-280 nm conduce a un daño en el DNA que es proporcional a la dosis de radiación. El daño principal es la formación de dímeros de pirimidinas entre bases adyacentes; los mecanismos de reparación son capaces de restablecer la integridad del DNA pero es improbable que funcionen en una espora durmiente. La radiación ultravioleta no es muy penetrante y no se puede confiar en ella como agente esterilizante, a menos que se pueda garantizar la exposición directa del organismo contaminante. Los rayos gamma y los rayos X son más útiles debido a su alto poder de penetración. Existen dos clases principales de efectos: (1)se produce un gran número de rupturas de cadenas sencillas y de la doble cadena del DNA (2)muchas moléculas dentro de la célula son ionizadas dando lugar a formas tóxicas altamente reactivas, como peróxidos y radicales libres, a los que los grupos - SH de las enzimas son particularmente susceptibles.

5 Agentes químicos Los agentes químicos esterilizantes pueden matar como resultado de su capacidad de oxidar o alquilar. Muchos son también tóxicos para el hombre, o carcinogénicos, y puede requerirse un equipo especial para su uso. Por ejemplo, el óxido de etileno es violentamente explosivo en mezclas con el aire, es crónicamente tóxico a concentraciones no detectadas por el olfato y puede producir hipersensibilización de la piel, eritema y edema. Determinación de la destrucción de los microorganismos Para matar organismos, cualquiera que sea el método, se requerirá una dosis letal, que dependerá de la duración del tratamiento nocivo. Por tanto, en los procesos de calentamiento, la relación temperatura/tiempo será lo más importante, en la radiación la energía de transmisión/tiempo y en la esterilización por agentes químicos, la relación concentración/tiempo. En todos los casos otros factores alterarán estas relaciones, por ejemplo la presencia de agua, de oxígeno u otros gases o agentes protectores como proteínas, temperatura, etc. Cualquier dato sobre mortalidad debe incluir las condiciones experimentales, y en particular, puesto que el tamaño de la población determinará la consecución del proceso de esterilización, siempre debe indicarse el nivel inicial de contaminación. Debido a dificultades experimentales en determinar los tiempos de muerte, puede encontrarse en la literatura una amplia variedad de valores para supuestamente la misma cepa u organismo.

6 Curvas de supervivencia de esporas de B. subtilis tratadas con calor seco a 160 º C, y crecidas sobre dos tipos de medios distintos. (Fig.1)

7 Definiciones El tiempo térmico letal (el tiempo más corto que lleva destruir los microorga­ nismos a una temperatura determinada) y el punto térmico letal (la temperatura más baja que se necesita para matar a los organismos en 10 minutos) son frecuen­temente citados, pero a menos que sean conocidos el tamaño inicial de la pobla­ ción y las condiciones precisas, no son particularmente útiles. Un parámetro más útil es el tiempo de reducción decimal o valor D, tiempo (en minutos, a una tempe­ratura determinada) que se requiere para reducir la población viable al 10 % de su valor previo. Fig. 2: Curvas de superviviencia de Bacillus subtilis MD2 tratado con calor húmedo a 105°C y crecido en agar con extracto de triptona y glucosa, expresada como fracción de supervivientes a fin de mostrar el número de extrapolación (3,0), el valor D (0,55 min) y el tiempo de hombro x (15 s).

8 Fig. 3: Curva del tiempo térmico letal de esporas de B. subtilis tratadas con calor húmedo, el valor Z es de 11 º C. El valor-Z es el cambio de temperatura que se requiere para modificar el valor D por un factor de 10

9 Cinética de muerte Bajo condiciones letales, los organismos de una población no mueren sincróni­ camente. Estadísticamente la inactivación durante un período finito (es decir a medida que la dosis letal aumenta) es proporcional al número de células viables al principio del período, es decir, la población muere exponencialmente. Por tanto una gráfica del logaritmo del número de supervivientes a cualquier tiempo (dosis) durante el tratamiento contra el tiempo transcurrido de tratamiento (dosis), producirá una línea recta (Fig. 1). Cuando el descenso logarítmico es constante desde el tiempo cero, como en la (Fig. 1), la curva es una forma de cinética de « choque único » (es decir, una lesión irreversible es suficiente para matar a una célula) y se describe mediante la ecuación: N/N o =e -kd Donde: N o : población inicial N: número de supervivientes después de la dosis o tiempo de tratamiento d: dosis o tiempo de tratamiento k: velocidad constante de muerte específica.

10 No todas las poblaciones exhiben cinética de « choque único » y la (Fig. 2) muestra una curva con un hombro antes del comienzo de la inactivación logarítmica. Cuando se encuentra un hombro, las cinéticas de supervivencia son de la forma: N/N o = 1- (1- e- kd ) n Donde: n: es un número de extrapolación igual a la intersección sobre el eje N/N o que da el número de « choques » requeridos para la letalidad O bien existe un requerimiento de choques múltiples para letalidad o alternativamente, cada « unidad » viable puede consistir en varias células o esporas diferentes y la in activación de la unidad no se observa hasta que cada componente sea inactivado. (En la práctica también se encuentran curvas de supervivientes no lineales). El valor D también se obtiene por interpolación como el tiempo transcurrido durante cualquier unidad de reducción logarítmica de los supervivientes sobre la parte recta de la gráfica, como se muestra en la (Fig.2). Cuando los logaritmos de los valores D a diferentes temperaturas se trazan frente a la temperatura, se encuentra que la relación es generalmente una línea recta de la cual puede ser obtenido directamente el valor z por interpolación (Fig. 3).

11 Mientras los valores D son muy dependientes de las condiciones, tanto de tratamiento como de recuperación (Fig. 1), los valores z son bastante menos dependientes de estos factores (Fig. 3). Los valores z pueden ser importantes para determinar los límites de un proceso ya que los materiales pueden ser incapaces de soportar ciertas temperaturas. Sin embargo, los valores z no pueden ser verdaderamente constantes a lo largo de un amplio rango de temperatura, ya que por debajo de una temperatura particular no ocurrirá ningún daño y el valor D sería infinito. Determinación de las condiciones de esterilización La dosis de esterilización requerida dependerá del nivel inicial de contaminación. Para una población que exhiba curvas de « choque único » (Fig. 1) a varias temperaturas o dosis de radiación, para cualquier número de esporas en la población. Inicialmente el cálculo de las condiciones del proceso que se requieren para cualquier grado de probabilidad de éxito en la esterilización se realiza fácilmente. Por ejemplo para una población contaminante de 108 organismos, la aplicación de 8 valores D de tiempo de procesamiento a una temperatura determinada reduciría el logaritmo del número de supervivientes a cero, es decir, a un organismo, y asumiendo un descenso logarítmico continuo en la población, un valor D adicional de tiempo de procesamiento representaría la probabilidad de 1 en 10 de encontrar un superviviente, es decir, de no esterilizar.

12 Unidad de letalidad Para comparar las capacidades relativas de esterilización de los diferentes procesos de calentamiento se requiere de una unidad de letalidad. La unidad escogida es el efecto letal de un minuto de calentamiento a la temperatura de 121 °C. La letalidad relativa puede ser expresada en términos de valores F basados en la relación: F= t x 1O (T-121)/z donde: t: tiempo de aplicación del tratamiento letal T: temperatura en ° C z: aumento de temperatura requerido para reducir el período de calentamiento en un 90 % (es decir el valor z). En el caso modelo t = 1 minuto de calentamiento y T = 121 ° C de forma que F = 1. En casos prácticos, donde la resistencia relativa de los organismos a diferentes temperaturas varía, se emplea el valor z de los contaminantes más resistentes a la temperatura. Las esporas más resistentes al calor que se encuentran normalmente, tienen un valor z de 10 ° C y este valor se utiliza si no se pueden llevar a cabo experimentos específicos. Utilizando z = 10 el valor patrón de F se denomina F 0 a la temperatura de 121 °C.

13 Tiempo de tratamiento y Ciclo de tiempo Independientemente de lo grandes que sean los volúmenes de líquido (e inclu­so más los de sólidos) que hayan de ser esterilizados, los tiempos de calentamiento y de enfriamiento se vuelven apreciables y ocupan la mayor proporción del tiempo del ciclo. Esto sucede incluso para lotes de medio a escala de laboratorio como se muestra en la (Tabla 1). Estos datos muestran claramente que con un tiempo establecido de 10 min., el tiempo de calentamiento era casi dos veces más largo para las unidades de volúmenes más pequeños y 6 veces mayores para las unidades de volúmenes más grandes. El calentamiento discontinuo de los volúmenes que se necesitan a escala industrial implicará tiempos considerablemente más largos de calentamiento y enfriamiento antes de que se pueda llevar a cabo la inoculación. Durante tales ciclos los efectos letales se extienden a lo largo de un rango mucho más amplio del ciclo que el tiempo real de mantenimiento y es necesario integrar el efecto letal sobre el programa conjunto tiempo-temperatura si se desea evitar el deterioro grave del medio (Fig. 4).

14 Fig. 4: Descenso de la producción de producto final en una fermentación debida a la degradación térmica de los nutrientes por aumento del tiempo de esterilización.

15 Tabla 1: Efecto del volumen del líquido y del número de recipientes sobre el tiempo requerido para que un líquido alcance 121°C en un autoclave Temperatura N?del líquidoTiempo paraTiempo Volumen de líquido/ recipientes/ al inicioque el líquido total del Recipientecarga (°C) alcance 121°C ciclo (min) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 030 2919 29 120 2634 44 210 2737 47 38 2643 53 45 2652 62 55 2660 70 64 2662 72

16 Calentamiento La esterilización puede ser en lotes o continua. Para la esterilización por calor el vapor debería estar siempre saturado, de forma que una pequeña bajada en la temperatura (por contacto con el material más frío) cause la liberación de vapor de condensación. Procesos discontinuos Autoclaves: Estos son vasijas relativamente pequeñas para la esterilización por vapor de volúmenes de hasta unas decenas de litros, para fermentación a escala de laboratorio y para la esterilización de fermentadores pequeños, y (por extensión) para ciertos productos estériles en la industria. Las autoclaves son controladas normalmente mediante manómetros y termómetros y ambos deben ser controlados. Todo el aire debe ser eliminado antes del ciclo de calentamiento, ya que mezclas de aire y vapor a una presión determinada alcanzarán una temperatura más baja que la del vapor puro a la misma presión. Al final del tiempo de mantenimiento debe permitirse un tiempo adecuado de enfriamiento durante el cual la presión debe descender lentamente. La liberación brusca de la presión causa rupturas o burbujeo violento y derrame del contenido al hervir. Cuando se cargan fermentadores, se debe tener cuidado acerca del estado de las válvulas y los cierres para permitir el acceso del vapor a los recipientes.

17 Inyección directa del vapor Un fermentador grande tiene generalmente adaptadas las tuberías y las válvulas necesarias para la esterilización de la vasija y de las tuberías de alimentación asociadas mediante inyección directa del vapor. En algunos casos puede añadirse al fermentador ya estéril el medio esterilizado sepa­radamente, pero también es posible esterilizar el lote de medio in situ. Si se utilizan inyecciones directas de vapor se debe tener en cuenta el hecho de que entre 10 y 20 % del volumen final serán debidos a condensación. Mientras la eficiencia térmica de este proceso es alta, la formación fuerte de espuma durante el burbujeo puede limitar la transferencia del calor. Asimismo muchos medios de fermentación pasan a través de una fase de viscosidad alta durante el calentamiento, particularmente en medios ricos en almidón. También se produce la formación de grumos sólidos a partir de « papillas » y el centro de tales grumos puede no alcanzar nunca una dosis letal total adecuada. Para minimizar estos problemas debe tenerse cuidado de mezclar y agitar los constituyentes durante la preparación y esterilización del medio. Otras falla en la esterilización pueden deberse al mal diseño de ingeniería cuando los orificios de inserción de los termómetros, las uniones, las aberturas de muestreo etc., producen grietas o cavidades en donde los agregados sólidos resisten los procedimientos subsiguientes de limpieza y esterilización.

18 Calentamiento indirecto Este se lleva a cabo indirectamente pasando vapor de agua a través de una espiral de intercambio de calor o de una camisa. En vasijas encamisadas el área que existe de transferencia de calor dependerá del diámetro del tanque y cuanto más grande sea la vasija más lenta será la velocidad de calentamiento. Para sistemas con espirales internos la relación área/volumen puede permanecer más o menos constante cualquiera sea el tamaño del reactor. El calor en este procedimiento es menos eficiente que por inyección directa y en ambos casos permanecen los problemas de enfriamiento mediante espirales. Deben tenerse en cuenta las reacciones no deseadas debidas al calentamiento. Es común entre ellas la oxidación de los fenoles y la reacción de Maillard, entre los azúcares reductores y los grupos amino (aminoácidos y proteínas) que originan productos de condensación, que puede inactivar gran parte de los carbohidratos y el nitrógeno aminado. Estas reacciones se ven favorecidas a pH alcalino. Sin embargo, parte de la « cocción » puede también aumentar el valor nutricional de un medio (Fig. 4). Dependiendo de los procedimientos disponibles puede ser posible esterilizar los ingredientes por separado y mezclarlos asépticamente y esto frecuentemente se hace en trabajo a escala de laboratorio. La esterilización generalmente causa una variación del pH, generalmente hacia pH más acido y es común el reajuste después de la esterilización.

19 Esterilización por flujo continuo Estos procesos tienen la ventaja de que son rápidos, ahorran espacio de planta (comparados con un esterilizador en lotes independiente) y debido al tiempo corto de los procesos, mejoran la calidad del medio. En el diseño del equipo deberían considerarse las tres etapas del ciclo a fin de conseguir: un calentamiento rápido un tiempo de mantenimiento a la temperatura de esterilización un enfriamiento rápido Los sistemas posibles se muestran en la Figura 5.

20 Inyección directa del vapor

21 Como los procesos discontinuos, este ofrece una eficiencia alta de transmisión del calor y bajo costo de capital. El vapor se inyecta directamente en el medio que fluye a través de un mezclador de tipo Venturi y el flujo se mantiene a la temperatura de esterilización (140 º C) en una espiral perfectamente aislada térmicamente, en la que el tiempo de residencia determina el valor F de tratamiento. Luego se pasa directamente a una refrigeración rápida. El enfriamiento más rápido se consigue por evaporación instántanea: el fluido desde la espiral de mantenimiento pasa a través de una válvula de entrada a una cámara de expansión en la que la caída rápida de la presión causa la vaporización del vapor y la temperatura baja a aproximadamente 100 °C. Una desventaja es el exceso de espuma que se origina. Alternativamente (o adicionalmente) el enfriamiento puede llevarse a cabo en un intercambiador de calor utilizando el medio frío que entra como un absorbente de calor, con un ahorro considerable de energía. El enfriamiento hasta la temperatura de inoculación puede ser completado mediante un intercambiador de calor enfriado con agua.

22 Calentamiento indirecto por vapor

23 Para un calentamiento rápido puede utilizarse una placa intercambiadora de calor a través de la que se pasa vapor a 500-690 kPa (80-100 p.s.). El área de intercambio de calor puede ser considerable, comparada con el volumen que contiene, y el uso de materiales, como titanio ha permitido crear un equipo, fuerte eficiente, ligero y anticorrosivo. La limpieza y el montaje pueden también llevarse a cabo fácilmente con estas unidades; no se introduce ninguna condensación y las impurezas presentes en el vapor no entran en el medio. El mantenimiento y el enfriamiento se pueden llevar a cabo como en el caso anterior. Con ambos tipos de esterilizadores el calentamiento produce la coagulación de las proteínas del medio y el material insoluble puede causar problemas adhiriéndose a las superficies. El vapor conducido por tuberías también se utiliza para la esterilización directa (en línea) de válvulas, cierres y puertas de muestreo, así como de filtros de aire. Los requerimientos de diseño para estos son críticos, particularmente en plantas a escala industrial Esterilización por calor seco La esterilización por calor seco se lleva a cabo en hornos provistos de ventiladores para la circulación del aire caliente. La forma de empaquetar el material es de gran importancia ya que la transferencia del calor desde el aire seco es muy baja. Se usa para materiales sólidos, como material de vidrio del laboratorio, talco, etc. Para seguir la velocidad de calentamiento se emplean termosensores.

24 El vapor es inyectado directamente en el medio crudo, por lo que la temperatura sube casi instantáneamente a una T de esterilización predeterminada. El tiempo de mantenimiento depende de la longitud de la tubería en la sección de mantenimiento. El medio esterilizado se enfría instantáneamente al pasar por una válvula de expansión en una cámara de vacío. Debido a que el período de exposición al calor es corto la T puede subir hasta 140 º C sin dañar al medio.

25 Se lo usa en la industria de la fermentación. Los platos calentados con vapor suben la T del medio crudo que se mantiene por un cierto período de tiempo, y luego se enfría en otra sección del intercambiador. Aunque los tiempos para calentar y enfriar son mayores al de Inyección de vapor, son mucho más pequeños que para una esterilización batch (alrededor del 1 ó 2 %).

26 Cálculo del Tiempo de Esterilización en un Esterilizador Continuo La inactivación de organismos por calor en esterilizadores continuos, se describe según: Como la velocidad de muerte microbiana se expresa por dN / dt = - K N, el balance de materia con un esterilizador continuo en estado estacionario es: Haciendo un cambio de variables y reordenando: donde: Las condiciones de entorno son: (19)

27 La solución de la ecuación (19) con las condiciones de entorno es: puesto que: (20)

28 Efecto de diferentes tipos de flujo (valores de Nº de PeB diferentes) sobre la destrucción de los microorganismos (N/N 0 ) a velocidades diferentes de destrucción (medidas como N r = k L / u Se define un grado de esterilidad, N / N 0 que se grafica vs N r (k L/u), que está de acuerdo con la ecuación (20), PeB (uL / E z )

29 Cuando el nº de PeB tiende a infinito (flujo pistón ideal), las condiciones son más favorables para diseñar esterilizadores continuos, ya que es posible reducir la longitud de la tubería requerida para producir un cierto grado de esterilidad para una masa de medio determinada. El tiempo requerido para partículas microbianas en un esterilizador continuo para alcanzar la T de esterilización, después de la inyección de vapor es del orden de microsegundos para partículas de algunos micrones de tamaño. El tiempo de respuesta se define como: 0.632 (T H – T 0 ), donde T H es la T de la fuente de calor, y T 0 es la T del medio, será del orden de seg para sólidos de algunos mm de tamaño. Por lo tanto es importante que el medio sea clarificado antes de entrar a un sistema de esterilización continua. E z : coeficiente de dispersión axial n : nº de esporos Χ: x / L x: dirección axial L: longitud de la tubería del reactor, m n: n / n 0

30 n 0 : concentración a la entrada PeB: Nº de Péclet = u L / E z u: velocidad promedio del fluído a través de la tubería, m/hr, m/seg N r : k L / u adimensional t = L / u tiempo de mantenimiento nominal

31 Esterilización por radiaciones La esterilización por radiaciones se lleva normalmente a cabo con una fuente de cobalto-60 o de cesio-137. En cualquier caso deben aplicarse precauciones de seguridad muy estrictas y tales instalaciones son encontradas rara vez en los laboratorios normales. La longitud de onda más corta (de alta energía) de los rayos X los hace altamente penetrantes. Las células vegetati vas son menos resistentes que las esporas bacterianas, pero se encuentran variaciones considerables en los niveles de resistencia, dependiendo de la eficiencia de los sistemas de reparación. La atmósfera anoxigénica y la baja humedad relativa protegen contra la radiación, siendo el efecto letal siempre más grande en presencia de oxígeno y de alto contenido en agua. Como con la esterilización química los efectos sobre los medios de cultivo son complejos y difíciles de controlar y los cambios pueden continuar después de que la irradiación ha sido completada.

32 Esterilización química El formaldehído es efectivo solamente si puede garantizarse que entre en contacto con los organismos contaminantes. Tiene una difusibilidad y un poder de penetración muy pobres y un olor picante y duradero; solamente puede usarse en circunstancias especiales. El peróxido de hidrógeno ha encontrado un uso creciente en la industria alimentaria. Es un poderoso agente oxidante, que mata células vegetativas y esporas con actividad creciente con la concentración, temperatura y pH. Tiene la ventaja de que sus últimos productos de degradación, agua y oxígeno, son inofensivos y se utiliza a concentraciones entre 10-25 % w/v en la esterilización de la leche y de los recipientes utilizados para los productos alimenticios. El óxido de etileno (punto de ebullición 10,7 °C) y el óxido de propileno (punto de ebullición 33,9 °C) se usan en forma gaseosa en instalaciones apropiadas. El óxido de etileno es mucho más efectivo pero es altamente tóxico, irritante y explosivo en mezclas con aire. Su efecto letal sobre las bacterias depende de la humedad; las condiciones óptimas incluyen 40-80 % de humedad relativa y una temperatura de 60°C durante 3-4 h para una concentración de gas de 800-1.000 mg / 1. El proceso se utiliza cuando el equipo puede ser dañado por temperaturas altas.

33 Esterilización por filtración (aire) La filtración difiere de otros métodos de esterilización en el hecho de que los microorganismos no mueren, sino que son eliminados físicamente. El filtro debe ser esterilizado por algún otro procedimiento antes de que pueda ser utilizado para esterilizar un líquido o un gas. Existen dos tipos fundamentales: (a) filtros profundos y (b) filtros de pantalla. (a)Los filtros profundos están hechos de materiales fibrosos o en polvo, presionados o unidos, en una capa relativamente gruesa a fin de formar una trama de canales interconectados de tamaño variable. Están fabricados de fibra de vidrio, algodón, lana mineral, celulosa o fibra de asbestos y moldeados como planchas, tapones, pilas o cilindros dependiendo del diseño. Durante su uso las partículas penetran dentro del filtro y son atrapadas como resultado de un conjunto de factores que incluye la intercepción directa por las fibras, el impacto inercial, el movimiento Browniano, la convención y efectos electrostáticos. La eficiencia del filtro está relacionada en términos generales con la profundidad del lecho. La proporción de las partículas que pasan a través de una profundidad determinada del filtro, está dada por la relación siguiente:

34 N / N 0 = e – K x Donde: N o : concentración de partículas que entran en el filtro N : concentración de partículas que pasan a través de una profundidad determinada de filtro x : profundidad del filtro K : constante que dependerá de muchos factores como el tamaño de las partículas, el diámetro de las fibras, la porosidad, etc. Esta ecuación, en forma similar a la que describe la cinética de muerte, permite el cálculo de la profundidad de filtro necesaria para retener las partículas para cualquier probabilidad de fallo que se desee. Cuanto más grueso es el lecho del filtro, es más eficiente, pero también es mayor la resistencia a fluir, medida por ∆P, la caída de presión que causa. La (Fig. 6) muestra la dependencia de la penetración y de la caída de presión en filtros de fibra de vidrio respecto de la velocidad de flujo del aire.

35 Fig. 6: Relación entre la penetración del cloruro sódico y el flujo del aire y entre la velocidad de flujo y la caída de presión para filtros Microflow. Los diseños modernos de filtros profundos consisten en cilindros hechos de microfibras unidas de borosilicato, en los que las capas aumentan en finura y densidad de adentro hacia afuera, de forma que el área de mayor filtración está en las capas del filtro de las etapas finales, y el cilindro entero está encamisado en una malla de polipropileno que lo refuerza.

36 Las graduaciones se dan hasta un 98 % de captura (nominal) a 0,1 μm que en montajes apropiados permite velocidades de flujo de agua tan altas como 6.0001 - 1 a 0,4 bar (5,5 p.s.i.) ∆P. Las eficiencias y las velocidades de filtración de los gases son mucho más altas y se pueden obtener fácilmente diseños que suministren más de 3 m 3 s - 1 a 0,1 bar ∆P (a partir de un suministro de 7 bar). La eficiencia de filtración del gas disminuye fuertemente si se condensa líquido sobre el filtro, aumentando la resistencia y permitiendo que existan «canales» de forma que los organismos «crezcan a través» del lecho del filtro originando una contaminación más abajo en la línea. Frecuentemente se requieren suministros muy altos de aire estéril ya que una fermentación aeróbica puede requerir 1 volumen de aire (volumen de líquido) -1 min - 1 de forma que un reactor de 30.000 galones puede consumir casi 200.000 m 3 de aire por día. Los filtros de pantalla (filtros absolutos) se basan en un principio sencillo de tamización. Son membranas hechas de ésteres de celulosa u otros polímeros que tienen poros más o menos rectilíneos, de diámetro bastante uniforme, que excluyen las partículas contaminantes atrapándolas sobre la superficie del filtro. Puesto que las bacterias contaminantes más pequeñas tienen aproximadamente 0,5 μm o más de diámetro, un filtro de membrana de 0,45 μm de tamaño de poro eliminará las bacterias (pero no los virus).

37 Para conseguir velocidades de flujo altas se necesita una gran superficie de membrana y debe darse a las membranas un apoyo rígido para que soporten las presiones utilizadas. Las unidades modernas de filtros de aire consiguen ambos propósitos construyendo las membranas dentro de cilindros sobre un soporte rígido central, tal como el polipropileno, que tiene ranuras para permitir el paso del aire filtrado al núcleo central. La membrana está normalmente protegida además por una malla de material sobre la cual, en su capa más externa, existe otra malla de polipropileno encamisada en un prefiltro de microfibra de vidrio y nylon. Cualquiera que sea el tipo de filtro usado, debe ser esterilizado y muchos están diseñados para ser esterilizados directamente (en línea) ya sea con vapor de agua o con óxido de etileno. Las unidades pequeñas para suministro de aire estéril a un fermentador de laboratorio pueden ser esterilizadas in situ. Los filtros son también utilizados para esterilizar los gases emitidos por los fermentadores que contenen microorganismos en aerosol. En los cultivos de virus patógenos las partículas que escapan pueden ser tan pequeñas como de 0,05 μm de diámetro. En general debe recordarse que las partículas con un diámetro inferior a 5 μm

38 de diámetro penetran fácilmente en los pulmones y que la mayor parte de los organismos patógenos son considerablemente más infecciosos por inhalación que por ingestión.

39 Evaluación de la eficiencia de esterilización Termosensores con cartas registradoras asociadas permitirán la valoración fiable de un proceso térmico de acuerdo con los principios indicados anteriormente para la obtención de los valores F totales. Este es el método de elección para procesos en gran escala. Tubos de Browne: tubos de vidrio cerrados conteniendo 0,15 ml de un fluido rojo que cambiará gradualmente a verde a medida que la dosis de calor aumente. Son útiles para comprobar los procesos de calor húmedo y seco y dan una indicación precisa de los tratamientos tiempo-temperatura recomendados clínicamente que se han listado con anterioridad. Tiras de papel impregnadas de esporas. Estas son bioindicadores para los métodos de calentamiento, químicos o por radiaciones. Tiras de papel de filtro impregnadas con aproximadamente 10 5 esporas de Bacillus stearothermophilus para calor humedo y de Bacillus subtilis var niger para tratamientos por calor seco. Para comprobar el crecimiento de supervivientes después del tratamiento, se incuban las primeras a 55 º C durante 5-7 días en caldo de triptona, glucosa y extracto de levadura y las segundas a 37 º C. La indicación de la esterilidad es retrospectiva. Existen también varios tipos de ampollas con esporas. Tiras indicadoras Termalog S. Estos dispositivos responden al calor húmedo en el rango de 115-123 º C, indicándose la dosis de calor por la distancia de migración (en mm) de un colorante azul.

40 Cinta adhesiva de autoclave. Indica que el vapor, a un mínimo de 120 °C, ha alcanzado la cinta cuyas rayas se tornan de blancas a negras. No da una seguridad de esterilidad sino que simplemente indica que un objeto ha sido procesado mediante vapor. Pruebas de eficiencia de filtración Prueba del azul de metileno. Descripta en el British Standard 2831 la nube de prueba tiene una distribución de tamaño de partícula de 0,02-2 μm y 99 % de las partículas están por debajo de 0,6 μm de diámetro. Prueba del cloruro sódico. Descripta en el British Standard 3928 la distribución del tamaño de partícula de la nube de prueba es similar a la de la nube de azul de metileno. Para que haya esterilización, el filtro debe tener una prueba de eficiencia de sodio del 99,997 % o mayor, es decir, una penetración de menos de 0,003 % de NaCl a la máxima velocidad de flujo permitida por el diseño. Esporas de Bacillus. Una prueba diseñada en MRE (ahora CAMR), Porton, que utiliza esporas monodispersas de B. subtilis (rango de tamaño 0,7 a 1,0 μm) inyectadas en la corriente de aire suministrada al filtro y a partir de las cuentas obtenidas se calcula el valor del porcentaje de eficiencia.

41 Prueba del bacteriófago D. La nube de la prueba son bacteriófagos monodispersos (0,03 μm) y las muestras se recogen por precipitación mediante impacto electrostático, se cuentan por la formación de placas de fago y se calcula el porcentaje de penetración. Un filtro con una penetración de llama de sodio de 0,001 % tiene un equivalente de penetración de esporas de B. subtilis de aproximadamente 5 10 -6 % y una penetración de T3 de 5 10 -5 %.

42 Esterilización de Reactores Los líquidos, usualmente acuosos, pueden ser esterilizados por medios diversos, incluyendo radiación (ultravioleta, rayos x), ultrasonido, filtración, calentamiento, y adición de químicos. Solamente los dos últimos se usan ampliamente en procesos de gran escala. Pequeñas cantidades de líquidos que contienen vitaminas y otras moléculas complejas a veces se esterilizan pasándolas a través de membranas porosas. Nosotros nos vamos a dedicar al diseño de procesos de tratamiento con calor. Los requisitos para la destrucción de microorganismos viables y virus varían, dependiendo ampliamente del material y de su uso posterior. Ej: en la fabricación de la chucrut y en tratamiento de aguas de desecho biológico, la presencia de los microorganismos es necesaria para las reacciones deseadas. Inhibidores para el crecimiento de organismos no deseados desarrollan rápidamente en el alcohol, vinagre, y producción del forraje conservado en silos, por lo tanto aquí, los requisitos de la esterilización no son extremos. La pasteurización de leche involucra la muerte de la mayoría, pero no de todos los microbios que crecen activamente. Se debe evitar la destrucción de compuestos útiles y eliminar los microorganismos indeseables en el diseño de un equipo de esterilización y pasteurización.

43 Las fermentaciones de cultivos puros, de cultivos de tejidos, y algunos productos alimenticios requieren medidas más severas de esterilización. Esencialmente toda vida microbiana deben ser eliminada, aunque el grado de "perfección" también varía un poco. Por ejemplo, se pueden indicar consideraciones económicas: una probabilidad de contaminación [1 - P o en la ecuación 1 – P 0 (t) = 1 – e -Nt ] de 10 -2 es aceptable para un proceso de fermentación batch. En este caso nosotros esperaríamos 1 la pérdida de un lote por cada 100 debido a la contaminación. Los requisitos mucho más severos se dan en la industria del enlatando. Una sola espora superviviente de Clostridium botulinum puede causar una contaminación letal, tal que se requiere la eliminación completa de los mismos. Típicamente, un criterio de diseño especifica que la probabilidad de supervivencia de una espora (1 – P 0 ) debe reducirse al menos a 10 – 12. En la esterilización de un reactor es importante la conversión completa del sustrato (esporas y células vegetativas) en productos (esporas inactivas, células muertas).

44 Cinética de Muerte Térmica de Células y Esporos La actividad de células, esporas, y virus puede disminuirse en el aire o líquidos por destrucción con ( calor, radiación, medios químicos ó mecánicos), remoción por métodos mecánicos (filtración o centrifugación, flotación, ó electrostáticamente), o inhibición (refrigeración, desecado, el eliminación de agua, ó químicos). Aunque las células pueden romperse y morir por abrasión mecánica en escala pequeña, éste método no es satisfactorio industrialmente. Similarmente, rayos x, rayos β, luz ultravioleta, y ultrasonido no son aplicables en esterilizaciones de volúmenes grandes de fluídos. Los rayos γ son útiles en la industria de los alimentos. Los métodos de esterilización en continuo son de interés creciente, pero para que la operación sea exitosa se debe controlar la formación de espuma, y además la viscosidad del medio debe ser relativamente baja. Ventajas de una esterilización en continuo Aumenta la productividad, ya que el período corto de exposición al calor minimiza los daños a los constituyentes del medio. Hay un mejor control de la calidad. Se nivela la demanda del vapor para el proceso. Son sistemas apropiados para el control automático.

45 La mayoría de los medios en la industria de la fermentación se esterilizan por métodos batch, aunque eso significa una sobre exposición del medio al calor. Para la esterilización líquida predominan el calentamiento industrial y desinfección con cloro (el agua de uso municipal ), y la filtración de partículas para la esterilización de aire. Los últimos dos procesos dependen de la transferencia de masa. La figura de la diapositiva siguiente ilustra los datos experimentales para la muerte de una célula vegetativa y de una espora en un rango de temperaturas. En general, las células tienen una susceptibilidad mayor para la destrucción que las esporas, ya que la formación de endosporas es un mecanismo de supervivencia de algunas células. Similarmente, los virus como los bacteriófagos también se inactivan también por tratamiento térmico, por lo que la esterilización térmica en la industria de la fermentación disminuye ambos, la población microbiana viable de la corriente líquida de nutrientes y de su contenido en virus ó titulo.

46 (Fig. 1)

47 También, la velocidad de los procesos moleculares que llevan finalmente a la muerte celular dependerá de la composición del entorno, incluso la concentración del solvente. La experiencia sugiere que pueda ser más seguro considerar la desactivación de las estructuras deficientes de agua como lo son los virus y esporas, que requieren de una hidratación inicial, seguida de transiciones moleculares como la desnaturalización que puede ocurrir; un efecto similar de humedad relativa se encuentra en la velocidad de supervivencia de bacteriófagos activos. Una población celular tendrá un rango de edades de células. Además la naturaleza de la pared celular y la importancia relativa de varias rutas metabólicas cambian en la célula, con la célula y edad de la misma. Así, la resistencia de una especie a la destrucción térmica dependerá de su historia, un término que es a menudo difícil de hacer más cuantitativo. Por ejemplo, una población en fase exponencial tiene paredes celulares relativamente permeables que permiten un intercambio rápido de solutos con el medio externo. Si estos solutos afectan a la estabilidad de la proteína, Se puede esperar una diferencia consecuente en la respuesta de la fase exponencial.

48 La muerte de una célula en particular es probablemente debida a la desnaturalización térmica de una o más tipos de proteínas esenciales como las enzimas. Para diseñar esterilizadores se debe conocer la cinética de muerte de los microorganismos. Para determinar la velocidad de muerte microbiana se deben considerar los puntos siguientes: La suspensión de células ó esporos debe estar libre de agregados. No debe haber retardo en el calentamiento ó enfriamiento de las muestras que se van a examinar. La composición y valores de pH del medio debe ser tal que los efectos inhibitorios sobre el organismo sean mínimos.

49 El análisis comienza con el análisis de la cinética de velocidad de muerte, las líneas rectas de los gráficos de la (Fig. 1) corresponden a gráficos semilogarítmicos, y son consistentes con un decaimiento de 1º orden, para la población viable de nivel n. n 0 : [esporos] de células vegetativas a t = 0 k d : constante igual a la pendiente del gráfico semilogarítmico n: [esporos] al final del proceso de esterilización Un gráfico de ln k d vs 1 / T provee una línea recta, tal que la dependencia de la temperatura de k d se puede expresar con la ecuación de Arrhenius: El rango de valores de E d para la mayoría de las esporas y células vegetativas está entre 50 – 100 kcal / mol. El término conocido como factor de reducción decimal D r = 2.303 / k d, es simplemente el tiempo necesario para reducir la población viable por un factor de 10. (2)

50 Estas cinéticas son apropiadas para una [esporos ó células] lo suficientemente grande, en un sentido estadístico. A medida que disminuye ese nº se observan desviaciones, por ej: la desviación stándard de una distribución normal aumenta según 1 / n. En un modelo determinístico, la fracción de la población que permanece viable (suponiendo que no hay crecimiento bajo las condiciones de letalidad aplicadas), es: Suposiciones: cada microorganismo es independiente del otro y no existe reproducción, tal que la condición letal se aplica uniformemente, por lo que se puede hacer una aproximación estocástica al proceso de esterilización, tal que la probabilidad a cualquier tiempo t de la población remanente que contiene N organismos viables es: (1)

51 N 0 : nº de organismos viables iniciales en el fluído a ser esterilizado En un modelo estocástico k d puede interpretarse como la recíproca del tiempo de vida media del organismo. A medida que el nº de organismos cae a valores bajos, la suposición de una población uniforme que se pueda caracterizar por un valor de k d simple comienza a fallar. Mientras un nº considerable de organismos supervivientes son aceptables en algunas aplicaciones (en leche pasteurizada debe ser < 30000 células / ml), se debe aplicar requerimientos más severos en la mayoría de las fermentaciones de cultivos puros. En estos casos es importante examinar la probabilidad de extinsión, ej: la probabilidad de que todos los organismos sean inactivados. Para N = 0 en la ecuación (1) se obtiene la probabilidad de extinsión:

52 En el gráfico siguiente de la destrucción térmica de S. aureus en un buffer neutro fosfato, se observan las desviaciones positivas de las distribución al azar resultantes de la ecuación (1), sugiriendo que una fracción menor de la población es más resistente a la muerte térmica que la inmensa mayoría.

53 La probabilidad de que al menos un microorganismo sobreviva es: Para la situación usual, cuando N 0 >> 1, esta expresión toma la forma: donde: Podemos interpretar 1 – P 0 físicamente como la fracción de esterilizaciones que pueden esperarse que fallen, para producir un producto libre de contaminantes. Según el metabolismo de la célula, estas tienen rutas alternativas para usar una fuente de energía ó conducir una biosíntesis. Esto altera las chances para el organismo sobreviviente. Un análisis estadístico muestra que el valor esperado para un tamaño de población es:

54 ω es el nº de clases de estructuras subcelulares r: nº de unidades de cada estructura en cada organismo k d (t): velocidad específica de muerte principal para cada clase de estructura. En esta expresión hay una serie de decaimientos exponenciales, por lo que no será lineal en un gráfico semilogarítmico. De una manera similar, una solución que contiene m clases de células diferentes (esporos ó virus), puede en la mayoría de los casos comportarse como especies determinísticas, la resultante de la población viable total será la suma de los resultados individuales. Con valores apropiados individuales de k di : No responde a una línea recta en un gráfico semilogarítmico. Además los valores individuales de k di no están disponibles, algunos métodos para estimar los límites superior e inferior sobre los valores de n (t) / n 0 a partir de los datos iniciales son discutidos por Hutchinson y Luss. La validez de estas estimaciones depende de la seguridad de los datos de muerte iniciales, y además se requiere una evaluación de la derivada segunda

55 d 2 n / d 2 t para t = 0.

56 Determinación experimental de la velocidad de muerte microbiana Se hacen las suposiciones siguientes: La suspensión de células y esporos no deben tener agregados No debe haber retardo ni en el calentamiento ni enfriamiento de las muestras Los valores de composición y pH deben ser tales que no haya efectos inhibitorios sobre el organismo de prueba, para aislar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de muerte del microorganismo Los aglomerados de esporos aumentan la resistencia al calor comparado a las células solas, por lo que deben filtrarse las suspensiones para remover los aglomerados y proveer una uniformidad chequeada microscópicamente. El problema de retardo en el calentamiento y enfriamiento de las muestras, se resuelve usando los equipos siguientes:

57 La suspensión se sella en tubos capilares que se introducen en un baño caliente ó frío un cierto tiempo. El nº de organismos viables antes y después de la exposición a temperaturas elevadas, se determina por recuento en placa. (Fig. 2)

58 La suspensión de esporas se mezcla con una solución caliente ó fría, el volumen de cada solución depende de la temperatura deseada. Después de mezclar la suspensión pasa a una cámara adiabática donde el tiempo de retención se (Fig. 3)

59 Controla por una válvula de 4 pasos, la muestra se enfría instantáneamente en una cámara flash. En la tabla siguiente figuran los valores de k para esporos bacterianos y son del orden de 1 min -1 a 121 º C. Para células vegetativas es difícil encontrar valores de k porque pierden viabilidad casi instantáneamente a esa temperatura. Para células vegetativas los valores de k varían entre 10 y 10 10, dependiendo del organismo en particular.

60 Correlación de velocidad de muerte térmica para el B. stearothermophilus Fs 7954, k es la constante de velocidad de muerte térmica, T es la temperatura absoluta y E es la energía de activación igual a 68.7 kcal / gr mol.

61 Correlación de velocidad de muerte térmica para E. coli. Los puntos a baja T se determinaron con el aparato de la Fig 2, y los de más alta T con el aparato de la Fig 3. El valor de la energía de activación es igual a 127 kcal / gr mol.

62 Diseño de Equipos de Esterilización – Método Determinístico vs Método Probabilístico Distribución Life – Span Se define como la longitud de tiempo durante el cual los esporos están expuestos a una temperatura dada, y permanecen viables. Se supone que cada esporo viable tiene un life – span específico, y una suspensión de esporos tendrá la misma distribución. Si la relación N / N 0, siendo N el nº de esporos viables y N 0 el nº inicial de esporos viables, graficando vs tiempo (Fig. 1) a una temperatura dada, la velocidad de muerte observada es un valor global ó valor determinístico, porque los valores de N que permiten las determinaciones son del orden de 10 a 100. En una esterilización de medios N< = 1, por lo tanto el concepto de life span es significativo para una aproximación probabilística del objeto. Para una población de esporos iniciales y además individuales (N 0 ), con N i nº de esporos, y siendo t t el tiempo de life span a una dada temperatura. Considerando además la probabilidad asociada a esa distribución de life span,

63 t: valor promedio de life span El valor máximo de P r para una distribución life span se calcula a partir de las ecuaciones (1 y 2) por el método de Lagrange. Como N 0 es grande, se obtiene: α´ y β´ son constantes empíricas donde: k es un factor de normalización Considerando que: (1) (2) (3)

64 Si los valores de N i y t i son continuos más que discretos, la ecuación (3) se modifica según: Esta ecuación hace referencia a una distribución exponencial de life span de esporos individuales. De las ecuaciones (2), se obtiene: (4) (5) Sustituyendo la ecuación (4), en (5 y 6), se llega a: (6) (7)

65 De las ecuaciones (4 y 7): Integrando: De las ecuaciones N = N 0 e – kt y (9) se ve que la constante de velocidad, k (min – 1 ), en la muerte térmica de esporos se puede interpretar como el valor recíproco de life span de esporos únicos: (9) k: constante de velocidad de reacción, velocidad específica de desnaturalización, min -1, seg -1, hr -1 t: tiempo de life span t: tiempo de mantenimiento nominal, valor promedio de life span (8) (10)

66 Life span promedio para un aglomerado de esporos bacterianos De las ecuaciones (8 y 10) se define una fracción m de esporos viables cuyo life span es < que t a una temperatura dada, y se representa por la ecuación siguiente: Si elegimos un esporo de la población, la probabilidad de que ese esporo específico tenga una vida menos que t, se expresa como: La probabilidad P t que la life span de esporos únicos, n considerando el nº total para una temperatura dada es:

67 Si definimos f(t) n dt como la distribución de life span entre t y t + dt en un aglomerado específico, compuesto de n esporos únicos: Luego: Sustituyendo la ecuación (11) en la (12): (11) (12) El valor promedio, t n de life span se deriva de la ecuación (13) como sigue: (13)

68 (14) De la ecuación (14): Para valores grandes de n (n> = 10), el lado derecho de la ecuación (15) puede aproximarse a: (15) γ es la constante de Euler (s / M) n: nº de esporos s: flujo de masa del vapor en kg / seg, kg / min, kg / hr M: masa inicial del medio en una esterilización batch, kg

69 Un ejemplo de cálculo de la distribución de life span y valor promedio de t, usando las ecuaciones (13 y 14), con un valor de k = 1 min -1, se ontiene el gráfico siguiente: f(t) n vs t, k = 1 min -1

70 El valor promedio t n en la life span de aglomerados bacterianos aumenta apreciablemente con la adición de esporos únicos, n, al aglomerado. Supervivencia vs Cartas de Esterilización La probabilidad de que todos los esporos N 0 sean inactivados durante un período de tiempo t, a una temperatura dada es: y la probabilidad de que al menos un esporo sobreviva durante el calentamiento de tiempo t es: Para N 0 >> 1: donde: (17) (16)

71 Usando la ecuación (17) se puede graficar (1 – P) vs kt para N 0 distintos. De la ec (17) se ve que aumentando kt, la probabilidad de una esterilización no exitosa, (1 – P) coincide con el nº de esporos viables, N, se expresa por la reacción de 1º orden (N = N 0 e – kt ). Por otra parte, la correlación (1 – P) vs kt, se desvía de la ecuación de 1º orden, a medida que el término 1 – P se aproxima a 1.

72 Generalmente la velocidad de muerte de los esporos bacterianos a una dada T se miden graficando N ó N / N 0 vs tiempo. Esta expresión se puede comparar con la carta de supervivencia extrapolando hacia (1 – P) = 1, se observa un desacuerdo entre la carta de supervivencia con el gráfico (1 –P) vs kt, este último se llama carta de esterilización. Los primeros investigadores usaban una extrapolación de la carta de supervivencia cerca de valores de N>= 1, para estimar el tiempo requerido para una esterilización específica, pero se debe incluir también el concepto de probabilidad. Hay que establecer el valor de N 0 como un criterio severo para alcanzar el grado de esterilización. En la industria de la fermentación se usa el punto de muerte térmica (tdp), tiempo de muerte térmica (tdt), y velocidad de muerte térmica (tdr) para comprobar la esterilidad. El tdp determina el punto de muerte térmica de una suspensión de esporos bacterianos que se exponen al calor durante un período de tiempo finito, lo más común es usar tdt para medir la longitud del tiempo requerido para inactivar una suspensión de esporos a una temperatura dada. Datos experimentales ya sea de tdp ó tdt se usan para las curvas de esterilización de la Fig. anterior.

73 Esterilización Batch de Medios Perfiles de Tiempo y Temperatura y Cálculos de Diseño En la figura se observan diferentes tipos de equipos que se usan para la esterilización batch de medios. En la Tabla siguiente se muestran las ecuaciones de diseño donde los perfiles de temperatura - tiempo se calculan para cada tipo de equipo. Se considera que las pérdidas de calor son despreciables.

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75 De dN /dt = - K N y k = α´ e – E / RT se tiene que: Integrando: donde: ∆ total es el criterio de diseño Los valores de T absoluta, T, son funciones del tiempo de exposición, t. En el diseño de esterilizadores batch, aplicando la ecuación (18) se puede determinar t. Debe tenerse en cuenta que algunos de los microorganismos contaminantes serán inactivados durante el tiempo requerido de al calentamiento (t 1 ), y enfriamiento (t 3 ) del volumen de medio. La ecuación (18) la puedo subdividir en: (18)

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77 donde: N: nivel de esterilidad (nº de microorganismos contaminantes después de la esterilización) N 0 : nivel de contaminación (nº de microorganismos contaminantes antes de la esterilización) N 1 : nº de microorganismos contaminantes después del período de calentamiento, t 1 N 2 : nº de microorganismos contaminantes después del período de mantenimiento, t 2 Supongamos que disponemos del perfil de tiempo y temperatura (Tabla), entonces es posible calcular ∆ para el calentamiento y el enfriamiento, como la solución analítica es tediosa se recurre a una solución gráfica:

78 k en min -1 y temperatura en º C vs tiempo en min

79 Bibliografía Bu ´ Lock J, Kristiansen B. “Biotecnología Básica”. Ed Acribia. 1991 Aiba Suichi, Humphrey Arthur E, Millis Nancy M. “Biochemical Engineering” 2 ed. Academic Press, INC. 1973 Bailey James E, Ollis David M. Biochemical Engineering Fundamentals. Mc. Graw Hill. 2º ed. 1986