1 Estrategias de Ingeniería Genética y Metabólica para Mejorar la producción de etanol de primera y segunda generación Jorge Alberto Vásquez Castillo. MSc cPhD. Docente Facultad de Ciencias Básicas Universidad Santiago de Cali.

2 Aspecto relevantes de cepas para producción de etanol a escala IndustrialTolerancia a etanol Osmotolerancia. Tolerancia cambios de pH. Tolerancia a estrés Mecánico. Caracterización Molecular Productividad de etanol (Qp) Rendimiento (Yp/s). Velocidad de hidrólisis Velocidad de consumo de sustrato Velocidad de conversión de azúcar a etanol

3 Operaciones unitarias para la producción de etanolMiel B o Jugo de caña de azúcar 12- 13% sacarosa ~ 2 - 3% hexosas Agua nutrientes Levadura Flujo de Aire Dilución del sustrato Producción del Inóculo Sustrato Diluido Inoculo Vinaza Diluida Fermentación Separación de Biomasa Destilación 3 Ethanol production in the Colombia is made by fermentation of products from sugar industry such as clarified sugar cane juice and/or B molasses ( diluted until 12%TRS), a process which uses yeast commercial species Saccharomyces cerevisiae as a catalyst. In most of the distilleries, this process is carried out in fermenters operating continuously and recycling vinasse Acido lactico 8000 ppm. Acido acetico ppm. Potasio 8000 ppm. Etanol 95% Vinaza diluida Deshidratación Evaporación Etanol anhidro 3

4 Inversión de la sacarosaHXT Invertasa-E Invertasa-I Hexosas-6P EMP Piruvato AGT1 Etanol CO2 Glicerol H+ H+ ATP ADP + Pi H+

5 Regulación de la expresión de la invertasaEn concentraciones superiores al 1% de hexosas (Glucosa o fructosa) ocurre la represion catabolica por carbono. Figura 6. Mecanismos moleculares de la represión catabólica por glucosa. Durante el crecimiento en medio con glucosa, la proteína represora Mig1 está en su forma no fosforilada, debido a la actividad de la proteína fosfatasa del complejo Glc7-REG1, el cual activa la unión de HXK2 y cyc8, que permiten que mig1 se una a la región reguladora del gen SUC2 por medio de la proteína Tup1, evitando así la expresión de la enzima invertasa (Gancedo Juana M, 2008).

6 Rutas Metabólicas para Px de etanolH2O Acetato Acetaldehido 2 Piruvato Glicólisis Acetil-coA Biosíntesis de Lípidos Mitocondria en O2 Piruvato Mitocondria sin O2 TCA Variante del Oxalacetato 2CO2 2ATP 2NAD+ 2NADH + 2H+ NAD(P)+ NAD(P)H + H+ ATP + CoASH AMP + PPi ATP+CO2 NAD+ +CoASH NADH + H++ CO2 1 2 3 5 6 4 ADH PDC 2.9. Expresión de receptores HXT y flujo de glucolítico. A pesar de más de un siglo de intensa investigación, los aspectos fundamentales del control del metabolismo glicolítico y el paso clave desde el piruvato hacia la vía fermentativa o vías respiratorias está parcialmente dilucidado. El transporte de la glucosa, la fosforilación de hexosas y las actividades fosfofructoquinasa y piruvato quinasa se han propuesto que son claves en el control de la glucólisis (Blazquez M. A, 199.; Diderich J. A 1999; Ernandes J. R. 1998; Pearce A. K. 2001; Reijenga K. A ). Sin embargo la sobreexpresión, ya sea individual o simultánea de las enzimas de la vía glucolítico no ha producido ningún aumento del flujo de carbono (Davies S. E. 1992; Hauf J. F. 2000; Heinisch J. 1986; Rosenzweig R. F. 1992; Schaaff I. 1989). Por otra parte, los intentos de correlacionar el flujo glucolítico con los niveles de expresión de los genes que codifican por estas enzimas en diferentes condiciones fisiológicas por lo general han fracasado (Larsson C. A. 1999; Nissen T. L. 1997; Van Hoek P.2000.). Esto es probablemente debido a que el control del catabolismo de la glucosa se distribuye en diferentes reacciones metabólicas, principalmente en aquellas relacionadas con el metabolismo redox (Fell, D. A. 1995). Se ha sugerido al transporte de la glucosa como uno de los más importantes reguladores del catabolismo de esta hexosa. (Narendranath, N. 2000). Salto de la Piruvato deshidrogenasa 6 6

7 Producción de etanol y glicerol de las cepas GG570-CIBI 4Producción de etanol y glicerol de las cepas GG570-CIBI 4.1; GG570-CIBII 9.1 y el control CBS8066 Producción de etanol con la cepa recombinante de Saccaromyces cerevisiae que porta los genes PDC y ADH de Z. mobilis (GG570-CIBII9.1 ▲), que la cepa que porta solo el gen PDC (GG570-CIBI4.1 ■) y que la cepa control (CBS8066♦). Vásquez y col. Ingeniería genética rutas metabólicas. Tesis 2007. 7 7

8 OBJETIVOS ESPECÍFICOS1. Aislar y caracterizar levaduras nativas con tolerancia natural a 65% v/v de vinaza. 2. Seleccionar la levadura nativa con mayor tolerancia a vinaza y sobreexpresar los genes suc2 de S. cerevisiae y adh2 de Zymomonas mobilis. 3. Determinar los niveles de expresión de los genes suc2 y adh2 por PCR en tiempo real en la levadura recombinante y compararlos con la levadura nativa 4. Comparar los parámetros de fermentación de las levaduras recombinantes y su control nativo con una levadura comercial, realizando fermentaciones con un medio que contenga miel B y de 65% de vinazas a escala Erlenmeyer y bioreactor operando en modo discontinuo.

9 METODOLOGIA GENERAL Diseño, selección y desarrolloAislamiento de levaduras nativas T103, Hoja y cogollo Medio de cultivo MVYS Objetivo No. 1 Caracterización intraespecífica Interdelta Caracterización Bioquímica y molecular AFLPs Criterios de selección Tolerancia a vinaza 65% Selección y adaptación Osmotolerancia Objetivo No. 2 Tolerancia a etanol método de selección 2DG Ingeniería Genética de la levadura Ensayos de susceptibilidad Construcción del cassette Genes Adh2 y Suc2 Objetivo No. 3 Transformación Electroporación Evaluación del nivel de expresión relativa de los genes Suc2 y Adh2 Genes normalizadores qPCR (PCR cuantitativa) Curvas de eficiencia Fermentaciones a escala Erlenmeyer 200ml % de Sacarosa, 3.55% de glucosa y 4.08 de fructosa Objetivo No. 4 Conteo celular Neubauer Parámetros de fermentación Densitometría Escala Bioreactor HPLC. Sugar Pack I y edetato de calcio (Fase Mov)

10 Aislamiento selectivo de levaduras nativas tolerantes a vinaza a partir de tanques de almacenamiento de mieles usando un medio selectivo Puntos de aislamientos en las destilerías Composición del medio MVYS - Miel B ajustar hasta 7% p/v de ART, Amonio bifosfato 300ppm, Vinaza 70% v/v, Cloranfenicol 100μg/ml, Agar bacteriológico 3.5% p/v, pH: 4,5.

11 Interespecífica Bioquímica IntraespecíficaCARACTERIZACION DE CEPAS Interespecífica Bioquímica Kit Api C-20 Extracción de DNA genómico levaduras Cuantificación DNA y pureza Nanodrop Intraespecífica Forward: Delta 12 5-TCAACAATGGAATCCCAAC-3 Huella Interdelta 12-21 PCR Reverse: Delta 21 5P-CATCTTAACACCGTATATGA-3P Dilución DNA = 10ng/µl Condiciones: 4min 95⁰C; 35 ciclos de 30s a 95⁰C, 30s a 46⁰C, 90s a 72⁰C EcoRI/MseI Digestión de 2.5ng/ul con AFLPs 0.04U de T4 DNA ligasa Ligación de adaptadores EcoRI-0: 5’GACTGCGTACCAATTC’3 TA: 58⁰C MseI-0: 5’GATGAGTCCTGAGTAA’3 PCR inespecífica EcoRI-AG /MseI-C EcoRI-AG/AC: 5’GACTGCGTACCAATTC/AG/AC’3 PCR especifica EcoRI-AC /MseI-C MseI/C: 5’GATGAGTCCTGAGTAAAC’3

12 Iniciadores para generar el constructo URA7-pTEF1-SUC2- pPGK-ADH2-URA7Diseño de constructos Iniciadores para generar el constructo URA7-pTEF1-SUC2- pPGK-ADH2-URA7 Iniciador Sequencia pb Tm TA opt Producto bp SU-F 5' AAATAATTACTAGTATGCTTTTGCAAGCTTTCCTT 3‘ 35 64.19 59.19 1599 SU-R 5' AAAAGAGCTCTACTATTTTACTTCCCTTACTTGGAACTTG 3‘ 40 63.26 58.26 AD-F 5' AAATTATTGTCGACATGGCTTCTTCTACTTTTTACATTCCA 3' 41 64.88 59.88 1155 AD-R 5' AAAATAAAGCTAGCTCATCAGAAGGCGGACAAG 3' 33 64.52 59.52 U7p-F 5' ACAAGTGGACTGTTAATTGGTAATAATT 3' 28 61.98 56,98 392 U7p-R 5' CGCCTTATTTTCTGTCTATAAGTTTCTTTTGTTCTATT 3' 38 61.35 56.35 U7t-F 5' CCAACGCATCAAAATTTTAGAATTAAAAGTCTACTGC 3' 36 60.50 55.50 297 U7t-R 5' AAGACTCTTATTTCTCATTTTGAAAGC 3' 27 62.30 57.30 Cons-F 5' CAAAAGAAACTTATAGACAGAAAATAAGGCGCGCCAAAC 3' 39 62.89 57.89 4815 Cons-R 5' TTTTAATTCTAAAATTTTGATGCGTTGGCCGATTCA 3' 63.89 NConst-F 5' AGCCTAGGGTTCTGTTCTTTGAC 3' 23 63.93 58.93 5315 NConst-R 5' AACAACTGTTGGCCAGTCGAAAA 3' 64.29 59.29 Procesos in silico Vector Nti Primer premiere Vector pSP-GM1-Suc2-Adh2 Vector pSP-GM1-Suc2

13 PROCESOS POSTERIORES A LA TRANSFORMACIONTransformación Por electroporación 1.5KV, 25 μF y 200Ω Extracción de ADN PCR para verificar presencia de los genes Colonias transformantes. 120h en medio YPS + 2DG a 30°C Parámetros de fermentación Po HPLC Repique en medio YPS Sacarosa 100g/L. 72h a 30°C Repique en medio YPS Sacarosa 15% 72h Cultivo en caldo YPS Sucrosa 100g/L 16h a 30°C Cultivo en caldo YPS Sucrosa 150g/L + A. acético y láctico 12h Fermentaciones a escala Bioreactor de 10Lts , medio con Miel (20% ART) Vinaza 65%, 24h, 30°C Repique a tubos de criopreservación YPS 10%, Glicerol 30%. 24h a 30°C Fermentaciones a escala 250ml Miel (15% ART) Vinaza 60%. 24h Expresión genica, qPCR Repique a tubos sland YPS 10%. 24h a 30°C Repique en medio MVYS 10% ART 72h a 30°C Parámetros de fermentación por HPLC Parámetros de fermentación por HPLC. Se usó la columna de separación Sugar Pack I y edetato de calcio como fase móvil Cultivo en medio YPS Sucrosa 150g/L 24h Repique en medio YPS Sucrosa 150g/L 72h

14 Etapas para la evaluación de las cepas recombinantes a escala Erlenmeyer y bioreactorCONDICIONES DE OPERACIÓN Fermentaciones escala Erlenmeyer 250mls. Miel B 15% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajusto a ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura. (24h) Fermentaciones a escala Bioreactor - Fermentación Tipo batch: 24 h - Materia prima: Miel B - ART ~ 19 % (w/w). 15.0% de sacarosa, 2.0% de glucosa y 2.0% de fructosa DAP: 300ppm Volumen de Trabajo: 10 litros Con adición de vinaza (65%) - Acidez volátil: 4000ppm con ácido acético pH: 4.5. Temperatura: 30 °C Agitación: 150 r.p.m.

15 Aislamiento a partir de destilería y caracterización de cepas58% Saccharomyces cerevisiae 42% otros géneros 100% Interdelta profile ≈ comercial 25% Saccharomyces cerevisiae 75% Candida sp. 100% Interdelta Profile ≈ comercial 75% Criptococcus sp. 25% Candida sp 72% Saccharomyces cerevisiae 28% Candida sp From 100% of S. cerevisiae 61,54 % Interdelta profile ≈ comercial 30,8 % Interdelta profile ≠ comercial 7,6% Non interdelta profile Basados en las características morfológicas y en el tamaño de la colonia en el medio MVYS (˃ a 4mm), se obtuvieron 18 aislamientos a partir del tanque de almacenamiento de mieles T103 (Figura No. 1), a las cuales se les dio la nomenclatura LCC2-14 a LCC2-31. El 100% de estos aislamientos presentaron tolerancia a altas concentraciones de vinaza y fueron caracterizadas bioquímicamente como Saccharomyces cerevisiae usando el Kit API 20C AUX, no obstante la mayoría de las cepas aisladas a partir del tanque T103 (El 70 %) presentaron marcadores moleculares idénticos a las cepas comerciales que se han estado usando en las mismas destilerías, razón por la cual se iniciaron nuevos aislamientos a partir de fuentes ambientales. 100% Saccharomyces cerevisiae 100% Interdelta profile ≈ comercial

16 AFLPs de Levaduras nativas y comerciales de S. cerevisiaeDistancias Fenéticas entre cepas El propósito del uso de los AFLPs en este trabajo, fue corroborar los resultados de los marcadores moleculares interdelta. En este sentido las combinaciones de iniciadores usados, EcoRI-AG/MseI-C y EcoRI-AC/MseI-C mostraron un alto polimorfismo permitiendo visualizar hasta 53 bandas por par de iniciadores (106 en total), con pesos moleculares que oscilaron entre 50 y 550pb de las que 85 (81,13%) resultaron polimórficas, (Figura 4). La heterocigocidad promedio fue de: Las distancias fenéticas de Nei’s entre una forma nativa y su progenitor entá entre el rango 0.02 and 0.09 (S. Coulibaly Theor Appl Genet (2002) 104:358–366),

17 Fermentaciones cepas nativas vs ComercialAzucares fermentable consumidos, población celular y conteo celular a las 24 horas de fermentación con levaduras nativas aisladas a partir de ambiente de destilería y hoja y cogollo de caña de azúcar, usando miel B con (15% de ARTs) y vinaza (50%).

18 Producción de etanol levaduras recombinantes usando medio industrial Escala Erlenmeyer 250mlsMiel B 19% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajustó a ppm de ácido acético y 4000ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura.

19 Resultados Comparación de la eficiencia, rendimiento y productividad volumétrica de las cepas nativas vs recombinantes Miel B 19% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajustó a ppm de ácido acético y 4000ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura. El incremento en Qp de la cepa 2-26E11-7 fue de 0,7g etanol/L * h

20 Expresión Relativa de los genes Adh2 y Suc2expresión relativa del gen Adh2 de las cepas recombinantes 2-26E11-8 y 2-26E11-4 Expresión relativa del gen Suc2 de las cepas recombinante 2-26E11-4 y nativa LCC2-26 wt. Cepa LCC2-26E11-4 (4.4 %p/v de etanol a las 12h) comparando con la cepa LCC2-26E11-8 la cual presenta el nivel más bajo de producción de etanol (3.7 %p/v a las 12h), Cepa LCC2-26E11-4 (4.4 %p/v de etanol a las 12h) comparando con la cepa LCC2-26WT con una producción de etanol de (3.1 %p/v a las 12h)

21 Cinética a escala bioreactor de 10Lts usando un medio industrial con alta gravedad específicaCinética de consumo de azucares fermentables y producción de etanol y biomasa por las cepas LCC2-26E11-4 y LCC-2-26 nativa El incremento en la producción de etanol de la cepa recombinante LC2-26E11-4 usando el medio miel B con 20% de azúcares fermentables, también mantuvo la tendencia observada en las fermentaciones realizadas usando el medio YPS (sacarosa 15% datos no reportados). Iniciando con una población celular de 50 x 106 se observa un incremento paulatino de la concentración de etanol en las fermentaciones realizadas con la cepa recombinante entre 0.5%, 1.0%, 1.82%, 2.25%p/v, a las 4, 8, 12 y 24 horas respectivamente con respecto del control LCC2-26WT

22 Velocidad de consumo de glucosa y fructosa en las fermentaciones realizadas con las cepas recombinante y nativa Velocidad de consumo de glucosa= ((Sacarosa hidrolizada/2) Glucosa Residual T(h-1))* (1-µ) - Concentración de Glucosa T (h) / Δ Tiempo Por otra parte el incremento del 168% (0.326 g/L*h) en la velocidad de consumo de glucosa y del 221% (0.43 g/L*h) en la velocidad de consumo de fructosa en la cepa recombinante LCC2-26E11-4 comparada con la nativa LCC2-26WT a las 4 horas (Figura 47), coincide con el aumento en la tasa de hidrólisis (figura 45) y con el incremento en la concentración de glucosa y fructosa (Figura 46).

23 Productividad volumétrica en las fermentaciones realizadas con las cepas recombinante y nativaEn el presente trabajo, se observó una relación entre el aumento en la tasa de hidrólisis (1.82 gL-1h-1), la velocidad de consumo de sustrato (0.326 g glucosa L-1h-1; 0.43 g fructosa L-1h-1) y la productividad volumétrica de etanol (0,359g de etanol/L*h), la cual fue evidente a las 4 horas de fermentación.

24 Embden-Meyerhof PathwayRequerimientos de la levadura para el crecimiento en residuos de lignocelulosa Xylose o Xylulose Xylulose 5P Pentose PO pathway Embden-Meyerhof Pathway Ethanol ATP ADP XI XKS

25 Xylose and glucose metabolic pathways in engineered xylose-utilizing SXylose and glucose metabolic pathways in engineered xylose-utilizing S. cerevisiae

26 Xylose Isomerase and Xylulokinase overexpression in Saccharomyces cerevisiae Xylose o Xylulose Xylulose 5P Pentose PO pathway Embden-Meyerhof Pathway Ethanol ATP ADP XI XKS pPGK1 pTEF1 XKS S. cerv XI Pyromyces USER VECTOR UP T1 T2 R-URA3-R DW XI Clostridium XI Bacteroides XI Cyllamyces Vasquez Jorge A.; Siewers Verena; Roldao Antonio, Nielsen Jens

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28 Construct purification and yeast transformationwt 1 2 3 4 CEN.PK 113-5D. MAT a; ura3-52; HIS3; LEU2 TRP1; MAL2-8c; SUC2. Originated from CEN.PK113-7D. deleted in URA3. Selective media: SOD-URA Wt. Construct 1. Construct URA3-XKS-Xi-Pi 2. Construct URA3-XKS-Xi-Cy 3. Construct URA3-XKS-Xi-Bs 4. Construct URA3-XKS-Xi-Cp

29 Xylose consumption YPX mediumFermentation in Shake flask within YPX medium Xylose consumption YPX medium YPX medium composition - Yeast extract 10g/L - Peptone 20g/L - Xylose 22g/L Conditions - 100ml Shake Flask fermentation - Aerobic conditions. - 200 rpm. - 30°C. - 172 hours The best strain consuming xylose is that which carrying Clostridium phytophermentas Xilose Isomease. 20g/L of xylose were consumed in 96 hours under aerobic conditions using complex media YPX. It was observed the yeast strain carring Piromyces xilose isomerase consuming 7g/L of xylose at 172h

30 Biomass production YPX mediumFermentation in Shake flask within YPX medium Biomass production YPX medium YPX medium composition Yeast extract 10g/L Peptone 20g/L Xylose 22g/L Strains CEN.PK 113-5D-Xi-Pi CEN.PK 113-5D-Xi-Cy CEN.PK 113-5D-Xi-Bs CEN.PK 113-5D-Xi-Cp CEN.PK 113-5D-Empty It was observed higher O.D. in the strain carrying Cp Xilose isomease which one reach a kind of stationary phase at 144h. While that strain carrying Pyromyces XI approaches to an O.D. of 4 at 172 hours in aerobic conditions.

31 Comp RT: 11.3min production YPX mediumFermentation in Shake flask within YPX medium Comp RT: 11.3min production YPX medium YPX medium composition Yeast extract 10g/L Peptone 20g/L Xylose 22g/L A maximum production of Compound with 11.3min of Retention time was observed at 96 hours in which the Xi-Cp strain which reached 1,4g/L, followed by Xi-Pi which produce 0,7g/L at 172 hours of aerobic fermentation

32 ? PPP Possible pathway to Xylitol formation from xylulose XI XKSXylitol RT: 11.6 xylitol dehydrogenase Xylulose XI XKS PPP Xylose RT: 12.5 Xylulose-5-phosphate

33 Gracias