1 Estructura y función de leucocitos - - granulocitos y monocitos - Dr Jorge Arbelbide Hospital Italiano de Buenos Aires Miercoles 23 de junio, 2010 Fisiologia de la Sangre Año 2010

2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS LEUCOCITOS GRANULOCITOSNEUTRÓFILOSEOSINÓFILOSBASÓFILOSMONOCITOS/MACRÓFAGOS FAGOCITOS

3 FAGOCITOS Células derivadas de la progenitora hematopoyética Engloban y digieren materia particulada Localizan, ingieren y destruyen agentes microbianos Síntesis y secreción de citoquinas, pirógenos y mediadores celulares

4 Stem cell UFC-GEMM UFC-GM UFC-E UFC-Meg Megacarioblasto Eritroblasto Mieloblasto UFC-G UFC-M UFC-B SCF, G-CSF, IL-1, IL-6, IL-10,bFGF, SCF, IL-3, IL-6, GM-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-3 Producción de granulocitos

5 Cinética de granulocitos neutrófilos y monocitos Neutrófilos Compartimiento mitótico MO MieloblastoPromielocitoMielocito Compartimiento madurativo/depósito MetamielocitoCayadosNeutrófilos Compartimiento vascular CirculantesMarginalesMonocitos Compartimento mitótico en MO promonocitos Compartimiento no mitótico monocito Compartimiento vascular Compartimiento tisular Tránsito (horas) 2326-7817-12668-10812-960-1204-104-101602436-104días-meses Celularidad (10 9 /kg) 0,140,511,952,73,62,50,30,40,0060,100,024?

6 Estructura del Neutrófilo Filamentos citoesqueléticos (locomoción, fagocitosis,exocitosis) Actina:periférica malla de exclusión de organelas proteínas de unión relacionan con membrana Microtúbulos: citoplasma perinuclear próximo al Golgi Célula compuesta por:  Nucleo lobulado (3-4 lobulos).  Citoplasma con granulos (primarios, secundarios y terciarios)  Pocas mitocondrias y organelas  Ap. de Golgi y el Sistema Reticuloendoplasmico pequeño  Citoesqueleto con filamentos especializados

7 Contenido de gránulos de neutrófilos PrimariosAzurófilosMembranaCD63CD68Matrix mucopol. Ácido alfa antitripsina alfa manosidasa azurocidina prot incr permeab bact colagenasascatepsinasdefensinaselastasa prot de trasp heparina lisozimamieloperoxidasasialidasaSecundariosEspecíficosMembrana Cd15 (LewisX) citocromo b558 recep formilpeptido G-prot rec laminina Mac-1 (CD11b/CD18) Rap 1 Rap 2 rec trombospondina rec TNF vitronectinaMatrix beta microglob colagenasahistaminasagelatinasaheparanasalactoferrinaTerciarios Gránulos de gelatinasa MembranaMac-1 rec formilpeptido diacilglicerol deacilasa MatrixgelatinasaacetiltransferasaVesículassecretorasMembrana fosfatasa alcalina citocromo b558 rec formilpeptido Mac-1 rec activador uroplasm Matrix proteína plasma

8 FUNCIÓN NEUTRÓFILA 1-Migración e ingestión 2-Opsonización y fagocitosis 3- Degranulación 3-Actividad respiratoria 4-Toxicidad independiente de O2

9 Mecanismos de reconocimiento de patógenos por Macrófagos y Células Presentadoras de Antígenos (CPA) 1) 1)Pattern-recognition receptor (PRR): Reconocen a los pathogen-associated molecular pattern (PAMP) Hay 3 clases: - Secretorios (actuan como opsoninas se unen a la bacteria y activan al complemento). - Endociticos (están en la superficie celular, reconocen los PAMP, favoreciendo su captura y endocitosis). - Amplicatorios de señales: Reconocen a los PAMP y traducen señales que inducen expresión de citoquinas. 2) Toll receptors: Reconocen al Lipopolisacarido (LPS) bacteriano unido a una proteína sérica Media expresión de CD80 y CD86 para la activación del linfocito T ante la presentación de antígenos. 3) Receptores del Sistema del complemento 4) Receptores para Fracción Fc de Inmunoglobulinas

10 Macrófago: Presentación de antigenos Receptores involucrados en la respuesta inmune inepecifica y especifica de la celula presentadora de antigenos El reconocimiento del pathogen-associated molecular pattern (PAMP) por los pattern-recognition receptors (PRR), como el toll-like receptors (TLR), generan señales que activan el sistema inmune especifico. La endocitosis de los PRR, como el receptor manosa macrofagico, unido a componentes de la pared bacteriana estimula la captación y fagocitosis de los patógenos por las células presentadoras de antígenos (macrófagos y células dendríticas). Las proteínas derivadas de los microorganismos son procesadas por los lisosomas para generar péptidos antigénicos, que van a formar complejo con el complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC) en la superficie del macrófago. Estos péptidos son reconocidos por los linfocitos T. Cuando la señal es generada por el reconocimiento de los PAMP por los PRR como el TLR, se produce expresión de citokinas y moléculas co-estimuladoras que van a permitir la activación del linfocito T.

11 Inicio de la respuesta inflamatoria por gramnegativos

12 1-Migración e ingestión Interacciones con endotelio durante la migración de neutrófilos Contacto al azar Rolling adherenciadiapedesisquimiotaxis selectinas Integrinas y Ig-like Activación de célula endotelial Estímulo extravascular Direc flujo Activaciónleucocitos quimiotrayente

13 Estímulo extravascular quimioatrayentes Receptores QUIMIOATRAYENTES DE NEUTROFILOS Y MONOCITOS LípidosPAF LTB 4 Intercrinas α IL-8 GROα β γ NAP-2 Intercrinas β MCP-1 (MCAF) RANTESOtrosFMLPC5a OrigenN,E,B,P,M N,M (met araq) M, endot, otras P MBacterias Activ complement Estímulos Ionoforos Ca FMLP, micr LPS, TNF, Il- IL-1, TNF Plat activ IL-1,TNF,LPS, PDGF IL-1,TNF,TargetN,EN,M,EN,BNNM,BM,BN,M,E,BN,M,E,B GRO= growth related gene, PAF: platelet activation factor, LTB4: leukotriene B4, NAP-2: neutrophil activating peptide 2, MCAF: monocyte chemotactic and activating factor, FMLP: formil-metionil-leucil-phenilalanina, RANTES: regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted

14 Estímulo extravascularRolling (apariencia en M.O iontravital) Unión de baja afinidad endot – N Intervención de selectinas de endotelio P-selectina la de mayor importancia Cuerpos de Weibel-Palade P selectina L-selectinaE-selectinaP-selectina Unión a carbohidratos grupos sialil N,M,L Linfo homing inflamaciónEndotelioinflamaciónEndotelio,P Dominio lectina Dominio EGF TNFIL-1

15 Estímuloextravascular Adherencia Receptores de integrinas leucocitarios Intracellular adhesion molecules (ICAM) en endotelio Fragmentos de complemento en endotelio La adherencia depende de la concentración del quimioatrayente LFA-1 Mac-1p150,95 CD11a CD18 CD11b CD18 CD11c CD18 ligando ICAM-1ICAM-2ICAM-3ICAM-1C3biFibrinogeno Factor X C3bi?Otros? distribuciónleucocitos GranulocitosMLGL GranulocitosMLGL Integrinas (β 2 CD18)

16 ICAMs (intercellular adhesion molecules) Superfamilia de inmunoglobulinas Receptor ICAM-1 (CD54) ICAM-2ICAM-3VCAM-1 Distribución Endot, otras EndotEndotEndotEstímulo TNF, IL-1 IFN, LPS NoNoTNF,IL-1LPSContrareceptorMac-1LFA-1p150,95VLA-4 Función Adhesión L Adhesión L,M

17 Integrinas y selectinas en la adhesión leucocitaria a endotelio

18 Es en momentos de anormalidad cuando la Naturaleza revela sus secretos J.W.Goethe

19 Alteraciones de CD18 (β2 integrinas) LAD I: leucocyte adhesion deficiency Estructura de CD18 y sitios de mutaciones identificados en LAD (leucocitosis, pobre cicatrización, infecciones bacterianas agudas repetidas) LAD II: deficit de selectina (desc reciente)

20 quimiotrayente Migración transendotelial (diapedesis) y quimiotactismo Diapedesis depende de β2 integrinas ICAM-1 Respuesta activa a gradiante de quimoatrayentes Liberación de colagenasa y gelatinasa rompe la MB

21 Quimiotaxis Movimiento direccional celular en un gradiente de concentración de una sustancia En los N movimiento con concentraciones menores que para degranulación y activación de cadena respiratoria Pseudópodos, lemelae, lamelopodios: en el área de empuje, sin organelas Núcleo en zona posterior del movimiento Requiere adhesión reversible (uPA – a GPI) Ensamblaje dinámico de la actina globular a filamentosa

22

23 Ciclo de la actina en pseudópodos de Neutrófilos.

24 2- Opsonización y fagocitosis Favorecer reconocimiento Posibilitar la ingestión de partículas extrañas opsoninasinmunoglobulinas Fragmentos de complemento opsonicas IgM,IgG1,IgG3 C3 Ig--------- receptores Fc (miembros de superfamilia de genes de Ig) Neutropenia allo y autoinmune: Atc contra receptor FcIIIB de N

25 Fagocitosis Fagocitosis: Se inicia con la union de partículas (material inerte, microrganismos o células muertas con receptores de la superficie celular. Esto genera el desarrollo de un corto pseudopodo en la superficie celular de los fagocitos (B). Las señales producidas actuan rapidamente sobre el citoesqueleto, principalmente sobre la actina que se reorganiza y permite la extensión del pseudopodo. En el proceso de fagocitosis, la formación del fagosoma sobre la membrana, ocurre por un proceso de invaginación (Aa). Por un proceso llamado exocitosis focal (Ab), se pueden reciclar los endosomas de la superficie celular, constituyendo una potencial fuente de membranas para la formación del fagosoma. Tambien participan en la fagocitosis como fuente de membranas, el Sistema Reticuloendotelial (ER) (Ac). En algunos casos, los lisosomas (Ly) y los granulos azurofilos (AG), de los neutrofilos, pueden fusionar sus membranas plasmaticas durante la fagocitosis (Ad). Despues de esta formación, los fagosomas se fusionan en forma secuencial con los endosomas, lisosomas, las proteinas de membrana asociada a lisosomas (LAMP) (C) o calnexina(D) se pueden observar en fagosomas aislados indicando la contribucion de las membranas del RE en la biogenesis de estos compartimientos.

26 3- Degranulación Fusión de gránulos con membrana de fagososma o plasmática Respuesta a aumento de concentración de Ca Vesículas secretorias (Mac-1) Ca (exocitosis) Gránulos azurófilos se unen a fagosoma Ca gránulo fagosoma Parásitos intracelulares (–) degranulación: Micobacterias, Legionella, Toxoplasma Salmonella, Listeria Vesícula secretoria

27 Estímulo infeccioso: Fusión de gránulos:vacuolización granulaciones tóxicas (gr prominentes) cuerpos de Döhle (retículo endopl retenido) Cambios morfológicos = cambios en expresión de genes transcr trad mRNA mieloperoxidasa sólo mieloblastos y promielocitos transcr trad mRNA lactoferrina sólo mielo y metamielocitos

28 4-Toxicidad dependiente de O 2 PMN en reposo E= glicolisis Bajo consumo de O Aumento +100 veces Consumo de O2 segundos Agte microbiano opsonizado activado “explosión” respiratoria Radical superóxido NADPH oxidasa

29 1= NADPH oxidasa 2= superoxido dismutasa 3= no enzimático catalizada por Fe 4= mieloperoxidasa 5= espontáneo 6= glutation peroxidasa 7= glutation reductasa 8= G6PD 9= glutation sintetasa Reacciones de actividad respiratoria en PMN

30 Modelo de activación de NADPH oxidasa Complejo enzimático Multisubunidades Enf Granulomatosa Crónica Citocromo b 558 Subunidades solubles

31 5-Toxicidad independiente de O 2 Suplemento de toxicidad oxidativa Proteínas antibióticas en gránulos LisozimaLactoferrina Factor de incremento permeabilidad bactericida Catepsina G DefensinasCatelicidinasSerpocidinas Ensayos terapéuticos Derivados porcinos Efectivas contras cepas resistentes de M tuberculosis

32 GRANULOCITOS EOSINÓFILOS Y BASÓFILOS

33 Eosinófilos 0,3% de celularidad en MO CFC-Eo estimulada por IL-5 Núcleo bilobado gránulos eosinófilos Funciones inmunomoduladoras Rol en infecciones helmínticas Mayor cantidad en tejidos que en sangre (1:300) Ritmo circadiano (+nocturno) de acuerdo a cortisol

34 EOSINÓFILOS : Procesos involucrados en la Eosinofilia: Los eosinofilos se desarrollan en la medula osea en respuesta a la estimulacion de las celulas progenitoras por la IL-5. Los eosinofilos maduros se adhieren en la sangre a las celulas endoteliales a traves de la interaccion de selectinas e integrinas(CD18 y VLA-4) con receptores endoteliales. La exposicion a sustancias quimiotacticas, permite que los eosinofilos migren por diapedesis desde las celulas endoteliales a los tejidos. La acumulación de los eosinofilos esta regulada por la produccion de factores que regulan su sobrevida y activacion (interleukina-3, interleukina-5 y granulocyte–macrophage colony- stimulating factor [GM-CSF]) de las celulas T y mastocitos.

35 EOSINÓFILOS Eventos que generan Eosinofilia en respuestas de fase tardía. Despues de la exposición al alergeno en personas sensibles hay 2 vías que llevan a la acumulación de eosinofilos: A) La exposición al alergeno interacciona con los receptores IgE de los mastocitos y basófilos produciendo la inmediata liberación de mediadores inflamatorios (histamina, prostaglandinas y leukotrienos).Los mastocitos generan citoquinas proinflamatorias (ej: Interleukina-1 y TNF ) que inducen en las células del epitelio respiratorio producción de citokinas de accion directa sobre el eosinofilo (ej: granulocyte–macrophage colony-stimulating factor [GM-CSF]). B) Otra via, el alergeno es reconocido por una celula presentadora de antigeno y presentado al linfocito T helper tipo 2 y esta celula regula la reaccion alergica y acumulacion de eosinofilos por generacion de citokinas ( IL-5 que estimula la produccion de eosinofilos y IL-4 que induce produccion de IgE y expresion de VCAM-1.

36 EOSINÓFILOS : El Eosinofilo y su contenido: Los granulos del eosinofilo contienen la proteína mayor básica (PMB) en su cubierta y su matriz esta compuesta por proteína cationica del eosinófilo (PCE), peroxidasa (MPO) y neurotoxina derivada del eosinófilo (NDE). El Eosinófilo también produce una variedad de citokinas algunas almacenadas en sus granulos y mediadores lipídicos que se generan luego de la activación celular. Expresan receptores para citokinas que le permiten interactuar con múltiples citokinas.

37 Gránulos eosinófilos Primario promielo promielo peroxidasa eo peroxidasa eo lisofosfolipasa lisofosfolipasa (polim: Charcot-Leiden) Secundarios o específicos mielo eosinófilos mielo eosinófilos prot. básica mayor prot. básica mayor prot catiónica eos. prot catiónica eos. neurotoxina del eos neurotoxina del eos Terciarios Terciarios mielo eosinófilos mielo eosinófilos fosfatasa ácida fosfatasa ácida sulfatasa sulfatasa

38 Proteína básica mayor (MBP) 50% proteína contenida en los gránulos del eosinofilo 50% proteína contenida en los gránulos del eosinofilo Adherencia a Schistosoma mansoni y Trichinella Adherencia a Schistosoma mansoni y Trichinella spiralis, produciendo lesion de su membrana. spiralis, produciendo lesion de su membrana. Liberación de histamina por basófilos Liberación de histamina por basófilos Inmunológicamente distinta a MBP Inmunológicamente distinta a MBP 30% del total de proteína de gránulos 30% del total de proteína de gránulos Tóxica contra parásitos (8-10 veces mas potente que la MBP) Tóxica contra parásitos (8-10 veces mas potente que la MBP) No es bactericida. No es bactericida. Se une y neutraliza heparina Se une y neutraliza heparina Proteína catiónica de eosinófilos (ECP)

39 Peroxidasa de eosinófilos (EPO) Mayor actividad que MPO Mayor actividad que MPO Inmunológica y genéticamente distinta de MPO Inmunológica y genéticamente distinta de MPO Efectos bioquímicos similares a MPO Efectos bioquímicos similares a MPO Neurotoxina derivada de eosinófilos Actua sobre fibras mielinizadas Actua sobre fibras mielinizadas Fenómeno de Gordon: administrada por via intratecal Fenómeno de Gordon: administrada por via intratecal produce toxicidad sobre sustancia blanca produce toxicidad sobre sustancia blanca Acción neurotóxica de elevada potencia Acción neurotóxica de elevada potencia Manifestaciones neurológicas de síndrome hipereosinofílico Manifestaciones neurológicas de síndrome hipereosinofílico

40 Función eosinófila Acción antihelmíntica y protozoarios Adhesión a superficie peroxidación con EPO toxicidad a larvas por MBP Modular las reacciones de hipersensibilidad Libera PgE1/E2 inh degranulación de basófilos Libera PgE1/E2 inh degranulación de basófilos Libera histaminasa. Libera histaminasa. Inactiva a sust liberacion lenta de anafilaxis Inactiva a sust liberacion lenta de anafilaxis y ag.quimiotacticos (aril-sulfatasa) y ag.quimiotacticos (aril-sulfatasa) Fosfolipasa B y D que inhiben al PAF. Fosfolipasa B y D que inhiben al PAF. MBP une a heparina de mastocitos MBP une a heparina de mastocitos Lisofosfolipasa modula las reacciones alergicas Lisofosfolipasa modula las reacciones alergicas

41 BASÓFILOS Mediadores reacciones de hipersensibilidad asmaurticaria rinitis alérgica anafilaxia Estimulados por mediadores solubles (IgE) Degranulación. Metabolitos araquidonato Progenitor común con mastocitos?

42 ESTRUCTURA DEL BASÓFILO Núcleo bilobulado Núcleo bilobulado Citoplasma Citoplasma Gránulos basófilos Gránulos basófilos Heparina Heparina Glicosaminoglicanos sulfatados (metacromasia) Glicosaminoglicanos sulfatados (metacromasia) Histamina Histamina Tripsina-Quimiotripsina Tripsina-Quimiotripsina Kalicreina Kalicreina Membrana Membrana Leukotrieno C4 Leukotrieno C4 IgE receptores IgE receptores Receptores de citoquinas( IL-2, IL-3,IL-4, IL-5) Receptores de citoquinas( IL-2, IL-3,IL-4, IL-5)

43 FUNCION DEL BASÓFILO Participa en la Reacción Anafiláctica: Se degranula por interacción de IgE con su receptor o ante estimulos Se degranula por interacción de IgE con su receptor o ante estimulos (C3a, C5a, proteínas lisosomicas del neutrófilo, frio, hormonas). (C3a, C5a, proteínas lisosomicas del neutrófilo, frio, hormonas). Libera sustancia quimiotacticas para el eosinófilo Libera sustancia quimiotacticas para el eosinófilo Es importante en las fases tardias de las reacciones alergicas Es importante en las fases tardias de las reacciones alergicas (aquellas que ocurren horas despues de la exposición al antigeno, por (aquellas que ocurren horas despues de la exposición al antigeno, por lo general en piel y pulmón) lo general en piel y pulmón)

44 FAGOCITOS MONONUCLEARES 10 – 18 u Células residentes tisulares: macrófagos Caract estearasa inespecífica Caract CD14 Fagocitosis Presentación de antígenos a linfocitos Producción de factores de crecimiento Producción de linfoquinas Reparación de heridas Mecanismos de remoción de detritos IFN gamma Linfocito T activación Jak/STAT

45 Cinética de neutrófilos y monocitos Neutrófilos Compartimiento mitótico MO MieloblastoPromielocitoMielocito Compartimiento madurativo/depósito MetamielocitoCayadosNeutrófilos Compartimiento vascular CirculantesMarginalesMonocitos Compartimento mitótico en MO promonocitos Compartimiento no mitótico monocito Compartimiento vascular Compartimiento tisular Tránsito (horas) 2326-7817-12668-10812-960-1204-104-101602436-104días-meses Celularidad (10 9 /kg) 0,140,511,952,73,62,50,30,40,0060,100,024?

46 Sistema retículo endotelial Sistema fagocítico mononuclear Bazo Hígado (células de Kupfer) Ganglios linfáticos Pulmones Médula Ósea Submucosa de tracto intestinal Osteoclastos Distinto progenitor: Células de Langerhans en epidermis

47 Productos secretados por fagocitos mononucleares EnzimasCeramidasaDNAsa Alfa naftil estearasa Catepsinas, elastasa Lisozima Fosfolipasa A Oxidantes Radicales hidroxilos Anión superóxido NO Proteínas transportadoras Haptoglobinagelsolina Proteínas de coagulación Factor tisular Activador de P PAI Metabolitos lipídicos PGE, PGF2 LeukotrienosCitoquinas IFN gamma IL-1IL-6 G-CSF, GM-CAF, M-CSF

48 Función antimicrobiana Ingestión y destrucción de parásitos intracelulares MycobacteriumListeriaLeishmaniaToxoplasmahongos Interacción con linfocitos B y T Inmunidad humoral y celular Actividad tumoricida

49 Muchas gracias