1 Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes Represores en la Leucemia Mieloblástica Aguda Ana Belén Valencia Martínez Servicio de Hematología Hospital Universitario La Fe Valencia, 28 Septiembre 2010

2 Introducción Leucemia Mieloide AgudaDefinición La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad neoplásica en la que se produce una proliferación anómala de células inmaduras (blastos) de estirpe mieloide. Las células blásticas proceden de un único progenitor hematopoyético defectuoso que presenta un bloqueo en el proceso normal de maduración así como un aumento de su capacidad de proliferación.

3 Progenitores mieloides Leucemia Mieloide AgudaIntroducción Leucemia Mieloide Aguda Eritrocitos Progenitores mieloides CMH Plaquetas Granulocitos Macrófagos Hematopoyesis normal Mutación Mutación Expansión clonal En el proceso normal de hematopoyesis, a partir de un precursor celular común e indiferenciado conocido como célula madre hematopoyética pluripotencial, se producen entre otras estirpes celulares los mieloblastos. Estos mieloblastos maduran gradualmente progresivamente para dar lugar a distintas lineas hematopoyéticas. Sin embargo, al igual que en otros tipos de cáncer, en la LMA alteraciones en estas células progenitoras provocarían una proliferación inadecuada y una capacidad indefinida de auto-renovación de éstas escapando a las señales de diferenciación y muerte celular programada. La acumulación de las mismas conllevaría un reemplazamiento de las células normales de la médula (llega un momento en que los blastos proliferan tanto que ocupan todo el espacio medular de manera que van desplazando a las células normales). Leucemia Mieloide Aguda

4 Introducción Leucemia Mieloide AgudaClasificación OMS 2008 En los últimos años ha habido una gran avance en la caracterización genética y molecular de la LMA de la LMA. Parte de estos progresos se han visto reflejados en la versión más reciente de clasificación de las neoplasisas mieloides establecido por la OMS en el año 2008, donde además de criterios morfológicos incluía algunas de las alteraciones citogenéticas y moleculares específicas de esta enfermedad. Esta clasificación no sólo es una herramienta útil desde el punto de vista del diagnóstico, sino también en la vertiente clínica al correlacionarse de una forma bastante precisa con el pronóstico. Esta clasificación reconoce como entidades independientes las leucemias con alteraciones genéticas recurrentes. La leucemia promielocítica aguda (LPA) con la translocación t(15;17) o las leucemias denominadas core-binding factor (CBF), t(8;21) e inv(16) o t(16;16), tienen una evolución clínica con tasas de supervivencia libre de enfermedad (SLE) que superan el 50% y son candidatas a tratamientos específicos. El resto de alteraciones dentro de esta categoría se asocian, en general, a pronósticos desfavorables, o bien quedan dentro de un grupo intermedio heterogéneo con comportamiento muy variable. Por otro lado, la LMA con displasia multilínea es la que presenta displasia en el 50% o más de las células de al menos dos linajes mieloides. Esta categoría puede ser secundaria, o no, a un síndrome mielodisplásico (SMD)/síndrome mieloproliferativo crónico previo. Por ello, es más frecuente en pacientes de edad avanzada y las anomalías cromosómicas son similares a las observadas en los SMD. Éstas suelen conllevar ganancia o pérdida de ciertos cromosomas, predominantemente los cromosomas 5 y 7, lo que afecta de forma negativa a la probabilidad de lograr una remisión completa (RC). Se reconoce un tercer grupo de leucemias secundarias que se desarrollan tras la exposición a quimioterapia citotóxica o radioterapia. Las alteraciones cromosómicas más frecuentes asociadas a agentes alquilantes, radiaciones ionizantes o ambos, afectan a los cromosomas 5 y 7 y frecuentemente son refractarias al tratamiento. En cambio, los pacientes tratados con inhibidores de la ADN-topoisomerasa II presentan alteraciones de 11q23 y 21q22. El último grupo engloba al resto de pacientes no definidos en las categorías descritas anteriormente y se clasifican según su estirpe y el grado de diferenciación de los blastos.

5 Introducción Leucemia Mieloide AgudaCitogenética RC (%) RR (%) SG (%) % En general, el pronóstico de los pacientes con LMA se ve influenciado por características propias del pacientes como la edad, estado general, antecedentes de quimio/radioterapia, trastornos hematológicos previos, etc. Y otros factores propios de la célula leucémica en sí, entre los que destacan las alteraciones citogenéticas y moleculares En concreto, el análisis citogenético al momento del diagnóstico es considerado como uno de los factores pronóstico más importantes y esto ha sido demostrado por diversos estudios que utilizando datos de un elevado número de pacientes los han estratificado en tres grupos de riesgo: favorable, intermedio y desvaforable, según las alteraciones encontradas en el cariotipo. El grupo favorable incluiría las translocaciones específicas (15;17), (8;21) e inv(16). Estos pacientes alcanzar tasas de RC superiores al 90% y una SG elevada. De manera opuesta, los pacientes con alteraciones etiquetadas como de mal pronóstico que afectan a los cromosomas 5 y 7 fundamentalmente o bien que presentan cariotipos complejos. Estos pacientes muestran una tasa elevada de fracasos al tratamiento de inducción a lo que se suma una alta probabilidad de recidiva y en consecuencia una corta SG. Por último quedaría un grupo muy heterogéneo en cuanto al pronóstico y respuesta al tratamiento que incluye la mayoría de LMA que presentan una miscelania donde destacan los pacientes con caritipo normal por su incidencia ya que engloba al 40-50% de los pacientes con LMA. Se han realizado un esfuerzo en la búsqueda de nuevos marcadores moleculares que ayudaran a delimitar diversos subgrupos de riesgo dentro del grupo de pacientes con cariotipo normal. En general, el pronóstico de los pacientes con LMA está condicionado por la edad, estado general, antecedentes de quimio/radioterapia o trastornos hematológicos previos, hiperleucocitosis etc. Sin embargo merecen especial atención las alteraciones citogenéticas y moleculares que, además de ser importantes para la precisa caracterización de las leucemias, también tienen implicaciones pronósticas y terapéuticas. En concreto, el análisis citogenético al momento del diagnóstico de la LMA es considerado como uno de los factores pronóstico más importantes. Diversos estudios demuestran que las alteraciones citogenéticas tienen una marcada influencia en la presentación y evolución de la LMA. Los hallazgos a nivel del cariotipo o su contrapartida molecular tienen un altísimo valor predictivo sobre las tasas de remisión completa (RC), la supervivencia libre de enfermedad (SLE) o riesgo de recaída (RR) y la supervivencia global (SG). Pero la importancia de la citogenética no sólo reside en la oportunidad de tener una aproximación pronóstico previa al tratamiento y que permita un intento de optimizar al máximo posible los recursos actuales, sino que también abre la puerta a la investigación de los mecanismos implicados en la leucemogénesis y el conocimiento de nuevas dianas terapéuticas que permitan individualizar el tratamiento en el futuro. A diferencia de otras patología, como la LMC, la citogenetica de las LMA son muy complejas ya que hay descritas una gran variedad de alteraciones distintas, siendo unas más frecuentes que otras. E hecho de que la citogenetica sea uno de los factores pronosticos mas importantes en la LMA ha sido demostrado por diversos estudios que utilizando datos de un elevado número de pacientes los han estratificado en tres grupos de riesgo: favorable, intermedio y desvaforable, según las alteraciones encontradas en el cariotipo. Es importante destacar que, aunque la edad sigue siendo un factor pronóstico muy relevante, la clasificación citogenética mantiene su valor en todos los grupos de edad en los que se aplica. Sólo varía la frecuencia de cada anomalía cromosómica como se ha detallado anteriormente. Atendiendo a estos grupos de riesgo se observan diferencias significativas en todos los índices de respuesta al tratamiento, incluyendo las tasas de remisión completa, el riesgo de recaída y la supervivencia global En esta figura extraída del estudio realizado por Grimwade y colaboradores se observa la SG de los pacientes con LMA según el grupo de riesgo citogenético definido. Sin embargo, el grupo de riesgo citogenético intermedio, que comprende a la mayoría de pacientes con LMA (66%), es un grupo altamente heterogéneo en el que, con toda probabilidad, se agrupan entidades diferentes en cuanto a etiopatogenia, pronóstico y respuesta al tratamiento. Dentro de este grupo destacan por su frecuencia aquellos pacientes que no presentan ninguna anomalía cromosómica detectable al microscopio. Así, entre el 40 y 50% de los pacientes con LMA (25% en el caso de los niños) tienen un cariotipo normal en el momento del diagnóstico. Los avances recientes en la caracterización molecular de estos pacientes han permitido la identificación de diversas alteraciones moleculares que pudieran jugar un papel determinante en la leucemogénesis y que han ayudado a delimitar diversos subgrupos de riesgo dentro del grupo de pacientes con cariotipo normal. Extraído de Grimwade et al. Blood 1998

6 Alteraciones molecularesIntroducción Leucemia Mieloide Aguda Alteraciones moleculares En esta tabla se describen las más relevantes por su incidencia y significado pronóstico. Destacar las más importantes ¿POQUE SON LAS MAS IMPORATantes? Como las mutaciones de FLT3 que se encuentran asociadas a un mal pronóstico y las mutaciones de NPM1 y CEBPa asociadas a un pronóstico favorable siempre que no vayan acompañadas de FLT3.

7 Alteraciones molecularesIntroducción Leucemia Mieloide Aguda Alteraciones moleculares Extraído de Schlenk et al. N Engl J Med 2008

8 Introducción Metilación del ADNEn el inicio y la progresión del cáncer intervienen tanto alteraciones genéticas como epigenéticas. Asociadas a silenciamiento génico. Las alteraciones epigenéticas son reversibles. NH2 NH2 En el inicio y la progresión del cáncer y por tanto en la LMA, intervienen tanto alteraciones genéticas como hemos visto anteriormente como las alteraciones epigenéticas. Estas alteraciones son fundamentales en la regulación de la transcripción génica. De hecho se ha visto que pueden ocasionar el silenciamiento algunos genes en particular genes supresores de tumores en cáncer. Si embargo a diferencia de la alteraciones genéticas, éstas son potencialmente reversibles, por lo que el existe la posibilidad de reactivar genes silenciados por alteraciones epigenéticas con objetivo de obtener un beneficio terapéutico. Entre los mecanismos de regulación epigenética destaca la metilación del ADN que consiste en la adición enzimática por una ADNmetiltransferasa de un grupo metilado en el carbono en posición 5 del anillo de citosina. Esta metilación tiene lugar únicamente en las bases citosina localizadas en dirección 5’ a una guanina y que son los denominados dinucleótido CpG. Las mutaciones, tanto si son heredadas a través de la línea germinal como si, más comúnmente, aparecen en los tejidos somáticos a lo largo de la vida, pueden ocasionar cáncer. Estas mutaciones pueden aumentar la función de algunos genes, los oncogenes, o bien causar la pérdida de función de otros, los genes supresores de tumores. Sin embargo, en el inicio y progresión del cáncer intervienen no sólo alteraciones genéticas (mutaciones, deleciones, etc.), sino también fenómenos epigenéticos que originan alteraciones trasmisibles en el patrón de expresión génica sin cambios en la secuencia primaria de nucleótidos del ADN y por lo tanto son reversible. Existen cuatro mecanismos principales de regulación epigenética: la metilación del ADN, las modificaciones de las histonas, el remodelado de los nucleosomas y los microRNAs. La metilación del nucleótido citosina es la modificación más frecuente en el genoma de las células eucariotas y se debe a la adición enzimática de un grupo metilo al carbono en posición 5 del anillo de la citosin. En el genoma de los mamíferos esta metilación tiene lugar únicamente en las bases citosina localizadas en dirección 5’ a una guanina en la secuencia 5'-CG-3', denominada dinucleótido CpG (Byrd et al, 1986) y está catalizada por el enzima DNA-metiltransferasa (DNMT). CH3 N DNMT N 4 4 3 5 3 5 2 6 2 6 1 S-adenosil-methionine 1 O O N N citosina 5-metilcitosina

9 Introducción Metilación del ADNExón 1 Exón 2 Exón 3 Los dinucleótidos CpG se agrupan en las regiones promotoras de algunos genes (islas CpG). Islas CpG no metiladas en regiones promotoras de algunos genes. La distribución en el genoma de los dinucleótidos CpG aquí representados es inusualmente asimétrica. La mayoría de dinucleotidos CpG que se encuentran metilados se posicionan en la gran proporción de ADN no codificante, para impedir la transcripción de regiones poco útiles del ADN como elementos repetitivos, secuencias virales, etc ya que su expresión podría resultar dañina para la célula. Por el contrario, existen regiones donde hay una mayor densidad de estos dinucleotidos que son las llamadas “islas CpG”, las cuales se encuentran no metiladas en las regiones promotoras de algunos genes permitiendo la expresión de los mismos. Existen alrededor de unos 30x106 pares CpG, el 70% están metilados en tejido normal esparcidas por el genoma, y el 7% están incluidas en islas CpG no metiladas y las pocas metiladas estan asociadas a la inactivación del cromosoma X, genes especificos de tejidos, imprinted… La metilación del ADN actúa sobre los genes a través de diversas vías: mediante el remodelado de la cromatina hacia un estado represivo, y convirtiendo las histonas y otras proteínas a un estado de no acetilación. Todo ello sugiere que la metilación no reprime por sí sola la transcripción y que se requiere una compleja interacción entre las HDACs, las metiltransferasas de las histonas, las MBPs y las Dnmts, entre otros, para producir el silencio transcripcional de los genes hipermetilados en el cáncer.

10 Introducción Metilación del ADNCélula normal Exón 1 Exón 2 Exón 3 Región promotora X Sin embargo, en cáncer el patrón de metilación normal se invierte, mostrando hipometilación en las áreas con baja densidad de pares CpG y una ganancia en la metilación de islas CpG de las regiones promotoras, lo que conlleva el silenciamiento de los genes que presentan estas islas. Respuesta hipometilacion en minuto 25 Exón 1 Exón 2 Exón 3 Célula tumoral

11 Genes hipermetilados en cáncerIntroducción Metilación del ADN Genes hipermetilados en cáncer Ciclo celular Reparación Apoptosis Adhesión Transd. señal Angiogénesis p15, p16, p14, p73, p21, p57, Rb hMLH1 hMLH2 MGMT BRCA1 DAPK TMS1 APAF Casp8 E-CAD TIMP3 MASPIN FAT APC, PTEN ER, SOCS1 RASSF1 HIC1 THBS1 Existe una larga lista de genes supresores de tumores silenciados por metilación aberrante en prácticamente todas las neoplasias humanas. Estos genes participan en rutas imprescindibles para el funcionamiento correcto de la célula como el ciclo celular, reparación del ADN, apoptosis, angiogénesis, etc. De manera que su pérdida de función en líneas generales puede suponer la aparición de fenómenos como un aumento en la proliferación celular e inestabilidad genómica y un descenso en la diferenciación y apoptosis, que son fenómenos que caracterizan la actividad tumoral. Estos genes desempeñan un papel importante Así pues el silenciamientoEl silenciamiento génico de genes supresores de tumores por metilación aberrante de sus regiones promotores se encuentra en todo tipo de neoplasias. Además, la lista de genes candidatos a genes supresores de tumores silenciados por hipermetilación de sus regiones promotoras en ciertas formas de cáncer crece constantemente. Se supone que estos genes desempeñan un papel importante en la tumorogénesis ya que forman parte de la mayoría de las vías moleculares que caracterizan la actividad tumoral. Estos genes estan por tanto implicados, en la regulación del ciclo celular, reparación del ADN, resistencia a fármacos, diferenciación, apoptosis, angiogénesis, etc. Proliferación Inestabilidad genómica Diferenciación Apoptosis

12 Agentes hipometilantesIntroducción Metilación del ADN Agentes hipometilantes DNMT Azacitidina CH3 CH3 ACGTCACGA Decitabina Como he comentado anteriormente las modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN, son cambios potencialmente reversibles. Existen dos agentes comercializados como son 5-azacitidina (AZA) y su derivado 5- aza-2´-desoxicitidina (DAC) son potentes inhibidores de la metilación del ADN. Estas moléculas son incorporadas a los ácidos nucleicos de las células en división, donde compiten con el conjunto de desoxinucleótidos endógenos de la célula por incorporarse en la nueva cadena sintetizada de ADN. Una vez incorporados en el ADN, los azanucleósidos forman enlaces covalentes con las DNMTs, de manera que éstas son incapaces de metilar la hebra de ADN. Así pues, la hipometilación inducida por estos agentes en células neoplásicas puede restaurar la función normal de genes implicados en vías que son críticas en el funcionamiento de la maquinarias celular. DNMT AAzGTCAAzGA

13 Introducción La vía de señalización WntVías de señalización PI3K/AKT WNT PI3K/AKT JAK/STAT Entre estás vías también destacan las vías de señalización que permiten una correcta comunicación célula-célula como la JAK/STAT, rutas controlados por receptores tirosin kinasas, la via hedghog, y la vía Wnt que constituye el núcleo de la presente tesis doctoral. implicadas en el crecimiento y desarrollo de los tejidos de un organismo, de manera que la alteración en el funcionamiento de estas vías podría desembocar en efectos devastadores durante el desarrollo o edad adulta ya que pueden intervenir en la aparición de enfermedades como puede ser el cáncer. En este esquema se ven representadas algunas de estas vías como vía JAK/STAT, rutas controlados por receptores tirosin kinasas, la via hedghog, pero quiero destacar la vía wnt que es vía en la que se ha basado este trabajo. Las vías de señalización que permiten una correcta comunicación célula-célula se encuentran implicadas en todos los aspectos del desarrollo de los distintos tejidos de un organismo para conseguir una homeostasis tisular y regeneración correctas. Por ello, un fallo en la regulación de la señalización podría resultar en efectos devastadores durante el desarrollo, o en la edad adulta, y desembocar en una enfermedad como el cáncer. Existen siete grandes vías de señalización célula-célula que dirigen y son responsables de la mayor parte del desarrollo de un organismo: las moléculas de membrana Notch-Delta, los transforming growth factors-β, los Hedgehog, la vía de los RTK, la vía de Janus kinase / signal transducer and activator of transcription, los mecanismos que implican a los receptores de hormonas nucleares y la vía de señalización Wnt.

14 Descripción de la vía WntIntroducción La vía de señalización Wnt Descripción de la vía Wnt Embriones: Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos. Adultos: Mecanismos de renovación, diferenciación y proliferación de las células madre. Implicada en distintos tumores. Durante el desarrollo embrionario, la vía Wnt regula el desarrollo y destino final de las células embrionarias para la formación de los distintos tejidos y órganos. Después en la edad adulta se encuentra implicada en los mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las células madre por lo que es esencial su funcionamiento a lo largo de toda la vía para mantener la homeostasis de los distintos tejidos. Sin embargo se ha visto que alteraciones en alguno de sus componentes puede tener efectos devastadores duratne el desarrollo y la edad edulta ya que pueden participan en la aparición de enfermedades como el cáncer, por lo que en los últimos años ha habido un especial interés en el estudio de la misma. Para ello, interviene en los procesos de la polaridad del citoesqueleo, gastrulación y organogenesis. Mientras que en la edad adulta intervienen en procesos de homeostasis de los tejidos, siendo esencial a lo largo de toda la vida. Por ello, alteraciones en el funcionamiento de la vía Wnt hacen que se rompa el equilibrio de la homeostasis ocasionando alteraciones patológicas como el cáncer. Debido a este último motivo, en los últimos años se ha dedicado especial interés al estudio de esta vía. Actualmente se conoce que las señales Wnt se traducen a través de diversos mecanismos de señalización diferentes, cuya activación depende de la especificidad de los ligandos Wnt y los receptores de membrana: la vía “clásica”, también llamada vía canónica y las vías no canónicas que regulan la organización del citoesqueleto durante la gastrulación (vía de polaridad celular), o cambios en los niveles intracelulares de calcio imporatantes para la adhesión celular y los movimientos celulares durante la gastrulación (vía Wnt/calcio)

15 Introducción La vía de señalización WntVía Wnt inactiva Lrp Wnt Fz Vía Wnt activa DKK sFRP P Fz Lrp GSK-3β CKLα APC axina β-Catenina LEF TCF ciclina D1 / c-myc Groucho Proteosoma Citoplasma Citoplasma β-Catenina β-catenina LEF TCF ciclina D1 / c-myc Groucho GSK-3β CKLα APC axina En la LMA hemos visto que tanto en las líneas celulares como en los pacientes los genes antogonistas Wnt se encuentran metilados de forma aberrante. De manera que no pueden ejercer su función de impedir la unión proteína wnt receptor. Así pues la via Wnt queda activada ya que al no darse la unión del complejo destructor, la catenina no es fosforilada y entra núcleo. ES por ello que se observamos un aumento en la expresión del gen diana ciclina D1 y de los factores de transcripción TCD,LEF, así como un aumento de la localización de b.catenina en el núcleo. Sin embargo tras el tratamiento con DAC, se observó un aumento en la expresión de los genes antagonistas Wnt al eliminar la metilación, por lo que recuperan su función de impedir la unión ligando receptor, lo que desmboca en la formación del complejo destructor en el citoplasma que fosforilaria la b.catenina, por lo que se ve una disminución de ésta en el núcleo y por tanto también una disminución de los genes TCF, LEF y ciclina D1

16 Introducción La vía de señalización WntVía Wnt inactiva Vía Wnt activa Vía Wnt inactiva DKK sFRP Citoplasma Citoplasma Wnt Lrp axina axina Lrp axina GSK-3β GSK-3β APC APC GSK-3β APC Fz Fz Fz CKLα CKLα CKLα β-Catenina β-Catenina P P P P P P En la LMA hemos visto que tanto en las líneas celulares como en los pacientes los genes antogonistas Wnt se encuentran metilados de forma aberrante. De manera que no pueden ejercer su función de impedir la unión proteína wnt receptor. Así pues la via Wnt queda activada ya que al no darse la unión del complejo destructor, la catenina no es fosforilada y entra núcleo. ES por ello que se observamos un aumento en la expresión del gen diana ciclina D1 y de los factores de transcripción TCD,LEF, así como un aumento de la localización de b.catenina en el núcleo. Sin embargo tras el tratamiento con DAC, se observó un aumento en la expresión de los genes antagonistas Wnt al eliminar la metilación, por lo que recuperan su función de impedir la unión ligando receptor, lo que desmboca en la formación del complejo destructor en el citoplasma que fosforilaria la b.catenina, por lo que se ve una disminución de ésta en el núcleo y por tanto también una disminución de los genes TCF, LEF y ciclina D1 LEF LEF Groucho Groucho TCF TCF Proteosoma Proteosoma ciclina D1 / c-myc ciclina D1 / c-myc

17 Introducción La vía de señalización WntDesregulación de la vía Wnt Cáncer de colon Neoplasias hematológicas DKK sFRP Wnt Carcinomas hepatocelulares axina Lrp Leucemias Fz GSK-3β APC Cáncer de colon CKLα Cáncer de colon Melanomas En la LMA hemos visto que tanto en las líneas celulares como en los pacientes los genes antogonistas Wnt se encuentran metilados de forma aberrante. De manera que no pueden ejercer su función de impedir la unión proteína wnt receptor. Así pues la via Wnt queda activada ya que al no darse la unión del complejo destructor, la catenina no es fosforilada y entra núcleo. ES por ello que se observamos un aumento en la expresión del gen diana ciclina D1 y de los factores de transcripción TCD,LEF, así como un aumento de la localización de b.catenina en el núcleo. Sin embargo tras el tratamiento con DAC, se observó un aumento en la expresión de los genes antagonistas Wnt al eliminar la metilación, por lo que recuperan su función de impedir la unión ligando receptor, lo que desmboca en la formación del complejo destructor en el citoplasma que fosforilaria la b.catenina, por lo que se ve una disminución de ésta en el núcleo y por tanto también una disminución de los genes TCF, LEF y ciclina D1 β-Catenina β-catenina LEF Groucho TCF

18 Hypothesis Alterations of different components of the Wnt pathway have been found in some hematological malignances providing evidence for the involvement of the Wnt pathway in leukemogenesis. We hypothesize that the functional loss of Wnt antagonists by promoter hypermethylation is a possible mechanism contributing to activation of the Wnt pathway in AML and that this loss may be involved in the pathogenesis and prognosis of this disease. Con todos estos datos nos planteamos la siguiente hipótesis: Alteraciones en algunos de los componentes de la vía Wnt se han encontrado en distintas neoplasias hematológicas indicando la implicación de la vía Wnt en la leucemogénesis. Así nuestra hipótesis es que la pérdida funcional de los genes antagonistas Wnt por metilación aberrante podría ser un posible mecanismo que contribuye en la activación aberrante de la vía Wnt así como en la patogénesis y pronóstico de la LMA.

19 Objectives To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC.

20 Objectives To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

21 Metodología Líneas celulares y pacientesKasumi-1 KG-1a HL-60 THP-1 184 pacientes con LMA 110 hombres, 74 mujeres Mediana edad: 60 años Citogenética: FLT3-ITD (n = 159): 31 NPM1 mutado (n = 105): 27 Favorable = 15 Intermedio = 111 Adverso = 38 Las muestra biológicas utilizadas en este estudio, fueron para los estudios in vitro modelos celulares de LMA: Kasumi, KG1a, HL60 y TPH1. En cuanto a la serie de pacientes estudiada se incluyeron

22 Objectives To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC. Para el objetivo número 1 donde se estudiaba la metilación de los genes antagonistas

23 PCR específica de metilaciónMétodos Estudio del estado de metilación PCR específica de metilación CpG Bisulfito sódico UpG CH3 MSP Cebadores M Cebadores U M U La metodología utilizada fue la PCR específica de metilación. Para realizar esta PCR hay un primer paso donde se hace una modificación química del ADN donde a partir de la incubación de la muestra con bisulfito se produce la conversión de las citosinas de los pares CpG no metiladas en Uracilo que después durante la PCR se cambia por un a timina, mientras que las citosinas de los pares CpG metiladas permanecen como tales. Una vez se tiene el ADN convertido este nos sirve como molde para realizar dos reacciones de PCR, una con una pareja de primers específicos para el ADN metilado convertido (primers M), y otra para el ADN no metilado convertido (primers U). De manera que cuando observamos el producto de PCR en un gel de agarosa se observa que una secuencia que estuviera metilada completamente amplificaría con los primers M y no con los U, y una muestra que no estuviera metilada solo amplificaría con los primers U

24 Metilación genes antagonistas WntResultados Estudio del estado de metilación Metilación genes antagonistas Wnt Líneas celulares Pacientes, n = 184 Se observó que todas las líneas celulares presentaban 4 de los 6 genes antagonistas estudiados metilados. En la serie de 184 pacientes con LMA, se encontró que todos los genes podían estar aberrantemente metilados pero con distintas frecuencias de metilación. Se hizo una clasificación de los pacientes de acuerdo al número de genes metilados: El 57% de los pacientes presentaban como máximo un gen metilado (grupo A), mientras que 80 pacientes (43%) mostraban de 2 a 6 genes metilados (grupo B). Este perfil de metilación se utilizó para los análisis de supervivencia que veremos más adelante. Grupo A (0-1 genes metilados): 57% Grupo B (2-6 genes metilados): 43%

25 Objectives To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC. Una vez comprobado que los genes antagonistas se encontraban metilados en la LMA, se evaluó el impacto que tenía la metilación sobre la expresión de estos genes mediante el uso del agente hipomentilane DAC

26 Métodos Reactivación de la expresión con DACExtracción ARN Tratamientos con DAC Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 RNA RNA HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM Para realizar este experimento, se hicieron 2 cultivos de cada una de las 4 líneas celulares. Uno que sería el cultivo control y el otro que sería tratado con decitabina durante 4 días. De todos ellos se realizó una extracción de ARN en a día 0 y 4 y de los cultivos tratados a día 4. Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a RNA RNA Día 4 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM

27 Métodos Reactivación de la expresión con DACExtracción ARN Tratamientos con DAC Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 RNA RNA HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM RNA cDNA Genes antagonistas Para realizar este experimento, se hicieron 2 cultivos de cada una de las 4 líneas celulares. Uno que sería el cultivo control y el otro que sería tratado con decitabina durante 4 días. De todos ellos se realizó una extracción de ARN en a día 0 y 4 y de los cultivos tratados a día 4. Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a RNA RNA Día 4 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM

28 Expresión genes antagonistas WntResultados Reactivación de la expresión con DAC Expresión genes antagonistas Wnt Ratio Normalizado de Expresión % sFRP sFRP2 sFRP4 sFRP DKK DKK3 sFRP sFRP sFRP sFRP DKK DKK3 sFRP sFRP sFRP sFRP DKK DKK3 Kasumi-1 KG-1a HL-60 TPH-1 sFRP sFRP sFRP sFRP DKK DKK3 sFRP sFRP sFRP sFRP DKK DKK3 DAC 2µM Día 4 Se observó que, en estos últimos, la expresión de los genes que se encontraban metilados aumentaba tras la exposición a DAC, mientras que la expresión de los genes que no estaban metilados permanecía prácticamente invariable. Es decir, con el uso del agente hipometilante decitabina se había recuperado la expresión de los genes metilados. Control DAC 2µM

29 Objectives To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC. Despues comprobamos si esta reactivación de los genes antagonistas tenía algún efecto sobre la activación de la vía Wnt. Para ello, se estudió si se producían cambios tras el tratamientos con la DAC en la expresión de los genes diana Wnt ciclina D1, y los factores de transcripción TCF y LEF. Además de estudiar la localización de la b-catenina en citoplasma y núcleo.

30 Expresión genes activadores WntResultados Activación aberrante de la vía Wnt Expresión genes activadores Wnt Ratio Normalizado de Expresión % ciclina D TCF LEF Kasumi-1 KG-1a HL-60 TPH-1 ciclina D TCF LEF ciclina D TCF LEF DAC 2µM Día 4 En primer lugar se midió la expresión los genes ciclina d1, TCF y LEF tras 4 días de exposición a DAC y se observó que los cultivos azules que habían sido tratados mostraban una reducción en la expresión de los estos genes. Es decir, la reactivación de los genes antagonistas implica una inactivación de la vía wnt que en este caso se ve reflejado con el descenso de la expresión de los genes downstream de la vía. Control DAC 2µM

31 Localización β-cateninaMétodos Activación aberrante de la vía Wnt Localización β-catenina Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM En segundo lugar se estudió la localización de la b-catenina en núcleo y citoplasma. De los mismos cultivos tratados con DAC también se recuperaron células para hacer extracción de proteínas en los cultivos control y tratados a día 4. Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 4 Proteínas Proteínas HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM

32 Métodos Activación aberrante de la vía WntWestern blot Extracción de proteínas Fracción CITOPLASMÁTICA Fracción NUCLEAR Para estudiar la localizacion de la b-catenina, se utilizó la técnica del Western blot para la que se hizo una extracción diferencial de proteínas citoplasmáticas y núcleares. Los anticuerpos utilizados fueron un antib-catenina y como control interno de la extracción de proteínas citoplasmáticas se utilizo el anticuerpo antib-tubulina y para las proteínas nucleares un anti-lamin A. Como controles internos de la extracción proteica se utilizaron proteina constitutivas en el caso de las citplasmaticas la b-tubulina y en el núcleo, la lamin.A β-tubulina β-catenina TOTAL Lamin A β-catenina TOTAL

33 Localización β-cateninaResultados Activación aberrante de la vía Wnt Localización β-catenina El western blot demostró que los cultivos al ser tratados con DAC disminuian la localización de la b-catenina en nucleo, mientras que los cultivos control no tratados la localización en núcleo era mayor. Este resultado demuestra de nuevo que la reactivación de los genes antagonistas por el agente DAC implicaba una inactivación de la vía wnt que esta vez se veía reflejado en la disminución de la b-catenina nuclear.

34 Resultados Activación aberrante de la vía WntCH3 DKK sFRP X + DAC LMA Wnt GSK-3β β-catenina CKLα APC axina LEF TCF ciclina D1 GSK-3β CKLα APC axina β-catenina P LEF TCF ciclina D1 Groucho X Lrp Fz En la LMA hemos visto que tanto en las líneas celulares como en los pacientes los genes antogonistas Wnt se encuentran metilados de forma aberrante. De manera que no pueden ejercer su función de impedir la unión proteína wnt receptor. Así pues la via Wnt queda activada ya que al no darse la unión del complejo destructor, la catenina no es fosforilada y entra núcleo. ES por ello que se observamos un aumento en la expresión del gen diana ciclina D1 y de los factores de transcripción TCD,LEF, así como un aumento de la localización de b.catenina en el núcleo. Sin embargo tras el tratamiento con DAC, se observó un aumento en la expresión de los genes antagonistas Wnt al eliminar la metilación, por lo que recuperan su función de impedir la unión ligando receptor, lo que desmboca en la formación del complejo destructor en el citoplasma que fosforilaria la b.catenina, por lo que se ve una disminución de ésta en el núcleo y por tanto también una disminución de los genes TCF, LEF y ciclina D1

35 Resultados Activación aberrante de la vía WntCH3 DKK sFRP X + DAC LMA Wnt GSK-3β β-catenina CKLα APC axina LEF TCF ciclina D1 GSK-3β CKLα APC axina β-catenina P LEF TCF ciclina D1 Groucho X Proteosoma Lrp Fz En la LMA hemos visto que tanto en las líneas celulares como en los pacientes los genes antogonistas Wnt se encuentran metilados de forma aberrante. De manera que no pueden ejercer su función de impedir la unión proteína wnt receptor. Así pues la via Wnt queda activada ya que al no darse la unión del complejo destructor, la catenina no es fosforilada y entra núcleo. ES por ello que se observamos un aumento en la expresión del gen diana ciclina D1 y de los factores de transcripción TCD,LEF, así como un aumento de la localización de b.catenina en el núcleo. Sin embargo tras el tratamiento con DAC, se observó un aumento en la expresión de los genes antagonistas Wnt al eliminar la metilación, por lo que recuperan su función de impedir la unión ligando receptor, lo que desmboca en la formación del complejo destructor en el citoplasma que fosforilaria la b.catenina, por lo que se ve una disminución de ésta en el núcleo y por tanto también una disminución de los genes TCF, LEF y ciclina D1

36 Expresión genes activadores WntResultados Activación aberrante de la vía Wnt Expresión genes activadores Wnt Pacientes ciclina-D1 TCF LEF P = 0,045 P = 0,023 P = 0,021 Ratio Normalizado IC 95% Ratio Normalizado IC 95% Ratio Normalizado IC 95% Por último comprobamos si la metilación de los genes antagonistas encontrada en algunos de los pacientes de LMA también repercutía en la activación de la vía. Para ello se comparó la expresión de los genes Wnt ciclina D1, TCF y LEF en el grupo de pacientes que presentaban como máximo un gen metilado con el grupo de pacientes que presentaba de dos a seis genes metilados. Y efectivamente se observó una mayor expresión de estos genes en los pacientes del grupo B lo cual es un indicador de la activación aberrante de la vía Wnt en los pacientes con LMA.. Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B

37 Objectives To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients. El cuarto objetivo fue analizar la asociación de la metilación de los genes Wnt individualmente y del pérfil de metilación con las características clinico-biológicas de los pacientes.

38 Características clínico-biológicasResultados Asociación con características clínicas Características clínico-biológicas Que incluían la edad, sexo, leucocitos, homoglobinas, plaquestas, la citogenéticas y la presencia de las mutaciones de FLT3-ITD y NPM1. No se encontró asociación entre la metilación de estos genes o el pérfil de metilación, excepto para la metilación del gen sFRP5 que era más frecuente en los pacientes del grupo de riesgo citogenético adverso

39 Respuesta a la inducciónResultados Asociación con características clínicas Respuesta a la inducción Con respecto a la relación con la terapia de inducción en términos de RC/fracaso y, en caso de fracaso, resistencia y muerte en inducción. De nuevo solo se encontró que la única asociación estadísticamente significativa era entre la metilación del gen sFRP5 y los pacientes que presentaban resistencia a la inducción.

40 Objectives To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients. Por último, el objetivo número 5 fue evaluar el impacto pronóstico de la metilación de los genes antagonistas en al supervivencia de los pacientes con LMA.

41 Resultados Análisis de supervivenciaSerie global Encontramos que los factores pronóstico independientes asociados a una peor SG fueron la edad, la citogenética y las mutaciones de FLT3, para la SLE fueron independientes estas mismas variables además de la metilación del gen sFRP5. Por último para la SLR, las únicas variables con carácter independiente fueron la edad y las mutaciones de FLT3. * HR: Hazard Ratio

42 ----- Resultados Análisis de supervivencia Pacientes ≤ 60 añosGrupo citogenético INTERMEDIO SG Supervivencia acum Meses P = 0,035 P = 0,046 SLE SLR P = 0,026 ----- FLT3-ITD Negativo FLT3-ITD Positivo Por último estudiamos también el impacto de la metilación y las características clínico-biológicas en la supervivencia de un subgrupo de pacientes más homogéneo que incluían los pacientes más jóvenes, menores de 60 años que pertenecían al grupo de riesgo citogenético intermedio. Como he comentado al principio de la presentación el grupo de riesgo citogenético intermedio presenta una alta heterogeneidad en cuanto a pronóstico y respuesta a la terapia, por ello evaluamos la posibilidad de obtener distintos subgrupos de riesgo de acuerdo a la metilación o las variables clínicas. En el análisis univariante los únicos factores que demostraron una significación estadística fueron las mutaciones de FLT3 donde aquí se muestran las curvas actuariales para la SG , SLe y SLR Obtuvimos que los únicos factores asociados a un peor pronóstico fueron las mutaciones de FLT3-ITD y el perfil de metilación, los cuales permanecieron como factores pronósticos independientes en el modelo de regresión de Cox para la SG, SLE y SLR.

43 ----- Resultados Análisis de supervivencia Pacientes ≤ 60 añosGrupo citogenético INTERMEDIO SLR SG SLE P = 0,011 P = 0,020 P = 0,032 Supervivencia acum Supervivencia acum Supervivencia acum Y el perfil de metilación. Sin embargo el análisis multivariante puso de manifiesto que la única variable con carácter independiente para la SG ern la presencia de las mutaciones de FLT3, mientras que para la SLR eran las mutaciones de FLT3 y el perfil de metilación. Meses Meses Meses Grupo A (0-1 genes metilados) Grupo B (2-6 genes metilados) -----

44 Resultados Análisis de supervivenciaPacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO * HR: Hazard Ratio Y el perfil de metilación. Sin embargo el análisis multivariante puso de manifiesto que la única variable con carácter independiente para la SG ern la presencia de las mutaciones de FLT3, mientras que para la SLR eran las mutaciones de FLT3 y el perfil de metilación.

45 Conclusions Aberrant methylation of the Wnt antagonists is a frequent event in cell lines of myeloid lineage and in patients diagnosed with AML. Indeed, we have found concurrent methylation of two or more genes in 43% of the AML patients. Aberrant promoter methylation results in gene silencing of Wnt antagonists.

46 Conclusions Treatment with DAC of the AML cell lines permit the re-expression of the Wnt antagonists and therefore, induce a reduction of β-catenin in the nuclear localization and downregulate the expression of the Wnt downstream genes. In concordance, the transcription levels of cyclin D1, TCF and LEF are significantly higher in patients showing more that two Wnt antagonist methylated genes. This is a strong evidence that epigenetic regulation contributes at least in part to the activation of the Wnt pathway in AML.

47 Conclusions Aberrant methylation of any individual gene and the methylation profile are not associated with clinical and biological characteristics of the AML patients in our series. The exception is for aberrant methylation of sFRP5, which is detected more frequently in patients with an adverse prognosis. Therefore, methylation of sFRP5 might provide valuable information about poor outcome in AML. 5. Methylation of two or more Wnt antagonistic genes is a new adverse prognostic factor in the subgroup of patients ≤ 60 years with intermediate-risk cytogenetics.