1 ESTUDIO DEL EFECTO SOBRE LA CINETICA DE CRECIMIENTO DE Aspergillus flavus y A.parasiticus POR SOBRENADANTES KEFIR Y DE BACTERIAS AISLADAS DEL KEFIR. León, A.1,2,3; Gamba, R.1,2,4; Giannuzzi, L.2,5; De Antoni, G.1,2,6. 1Cátedra Microbiología- UNLP. 2CIDCA – UNLP. 3Facultad de Química Farmacéutica - Universidad de Antioquia-Colombia. 4Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales-UNRC. 5CONICET. 6CIC-PBA.
2 INTRODUCCIÓN A.flavus y A.parasiticus causan pérdidas en alimentos: cereales y sus derivados. Aflatoxinas: B1, B2, G1 y G2: hepatotóxicas, mutagénicas y posibles carcinógenos y un problema de salud pública (Legan, 1993).
3 KEFIR COM0 BIOPRESERVANTEKefir: leche fermentada artesanal originaria del Cáucaso euroasiático. Microbiota compleja Descripto Código Alimentario Argentino: Art (Res. MSyAS N° 295 del ). Actividad antimicrobiana (Garrote y col, 2000; Golowczyc y col, 2008)
4 ANTECEDENTES DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICOActividad antifúngica de BAL (Magnusson, Ström, Roos, Sjögren, & Schnürer, 2003; Sjögren, Magnusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003, Hassan, & Bullerman, 2008). Actividad antifúngica compuestos sobrenadantes de cultivo (Corsetti, Gobbetti, Rossi, & Damiani 1998; Lavermicocca, Valerio, Evidente, Lazzaroni, Corsetti, & Gobbetti, 2000; Gerez, Torino, Rollán, & de Valdez, 2008). Inhibición tasa crecimiento KD (mm/h) e incremento fase Lag (h) con ácidos puros y SLC de kefir. (León y col, 2006, 2007, 2008).
5 Características de las BAL seleccionadas de kefirResistencia al pH ácido Resistencia a la bilis Producción de ácidos orgánicos Inhibición Escherichia coli, Salmonella typhimurium, S.enterica, S.gallinarum Shigella sonnei
6 OBJETIVOS Determinar la capacidad inhibitoria de los microorganismos aislados del kefir y comparar estos resultados con los obtenidos de sobrenadantes libres de células (SLC) de kefir, sobre el hongo toxigénico Aspergillus flavus AFUBA5. Determinar la capacidad inhibitoria de los microorganismos aislados del kefir sobre el hongo toxigénico Aspergillus parasiticus NRRL2999.
7 MATERIALES Cepas fúngicas: Cepas de BAL: L. plantarum CIDCA 8316A.flavus AFUBA5 A. parasiticus NRRL2999 L.plantarum 8312 MATERIALES Cepas fúngicas: A. flavus AFUBA5 (UBA) A. parasiticus NRRL2999 (UNQ) Cepas de BAL: L. plantarum CIDCA 8316 L. plantarum CIDCA 8313 L. plantarum CIDCA 8324 L. plantarum CIDCA 8327 L. plantarum CIDCA 83210 L. plantarum CIDCA 8334 L. plantarum Qf5
8 CULTIVO MICROORGANISMOSPreparación de BAL: Cultivo en leche estéril, 30 °C por 48 hs. Centrifugación por 15min a rpm. Obtención del SLC por filtración. Preparación cepas fúngicas: Cultivo siete días agar inclinado PDA, 30 °C. Diluciones: 104 conidias/ml.
9 METODOLOGíA x BAL aisladas de gránulos de kefir Incubación en lecheGránulos CIDCA AGK1-AGK2 Centrifugación y Filtración SLC Agar Malta Plaqueo SIEMBRA DE 10 µl EN EL CENTRO DE LA PLACA Cepa fúngica CUATRO MEDICIONES DIARIAS DEL DIAMETRO
10 PARAMETROS CINÉTICOS ESTUDIADOSTASA CRECIMIENTO KD (mm/h) INDICE DE INHIBICION DE LA TASA CRECIMIENTO: {(KDC – KDS)/ KDC}X100 FASE LAG (hs) INDICE DE INCREMENTO DE LA FASE LAG: {(LagSN - LagC)/LagC}X100
11 RESULTADOS
12 SLC DE GRÁNULOS DE KEFIR Y CEPAS AISLADASEfecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 y CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de A. flavus AFUBA5 SLC DE GRÁNULOS DE KEFIR Y CEPAS AISLADAS IILag IIKd AGK2 - pH3, % - 20°C 37,26 20,15 AGK2 - pH3, % - 20°C 282,55 34,66 AGK1 - pH3, % - 20°C 43,67 19,66 AGK1 - pH3, % - 20°C 102,2 26,11 AGK2- pH3, % - 20°C 5,86 7,45 AGK2 - pH3, % - 20°C 5,64 16,74 AGK1 - pH3, % - 20°C 32,6 3,33 AGK1 - pH3, % - 20°C 27,57 8,33 % 8,15 2,70 % 4,43 2,80 % 10,47 2,97 % 14,24 0,07 % 9,13 2,34 % 1,50 5,46 % -7,96 27,96 % -0,85 26,76 % -7,15 28,86 % -2,86 26,37
13 Efecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 sobre la Fase Lag y Kd de AEfecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 sobre la Fase Lag y Kd de A. flavus AFUBA5
14 Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de AEfecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de A. flavus AFUBA5
15 SLC de L. plantarum CIDCAEfecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de A. parasiticus NRRL2999 SLC de L. plantarum CIDCA IILag IIKd % 38,5000 -17,2300 % 14,4700 21,9600 % 45,5700 -17,9900 % 7,4100 23,6500 % 44,4900 -12,3400 % 13,5700 23,0900 % 42,7300 -19,7700 % 0,0000 24,8800 Qf % 12,2800 -14,7400 Qf % 2,4000 9,2600
16 Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de AEfecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase Lag y Kd de A. parasiticus NRRL2999
17 CONCLUSIONES Se determinó que los SLC de kefir obtenidos a 20°C de incubación inhiben al hongo toxicogénico A. flavus AFUBA5. Los SLC cepas de L.plantarum aislados del Kefir, inhiben el crecimiento de hongos toxigénicos A.flavus AFUBA5 y A.parasiticus NRRL2999, pero en una proporción menor que los SLC de kefir. El parámetro cinético mas afectado por los SLC, tanto de kefir como de cepas aisladas, es la Fase Lag. El efecto inhibidor de los SLC es mayor a medida que desciende el pH. Ya que aumenta la concentración de acido láctico en el medio.
18 CONCLUSIONES La capacidad inhibitoria contra los hongos es cepa-dependiente; está relacionada con la capacidad acidificante de la cepa y la producción de ácido láctico. Análisis de otros metabolitos diferentes a los ácidos orgánicos capaces de actuar a pH alrededor de 4,0. Continuar con la selección cepas potenciales o, mejor aun, consorcios no tan complejos como el kefir, para aplicar en fermentaciones y preservación de alimentos. Resaltar la importancia que tiene la comunidad microbiana del kefir y su complejidad; y lo relevante de estudiarlo desde el punto de vista sinecológico.
19 BIBLIOGRAFIA Legan, J. D. (1993). Moulds spoilage of bread: the problem and some solutions. International Biodeterioration Biodegradation, 32, Stiles, M. E. (1996). Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 70, Magnusson, J., Ström, K., Roos, S., Sjögren, J., & Schnürer, J. (2003). Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 219, Sjögren, J., Magnusson, J., Broberg, A., Schnürer, J., & Kenne, L. (2003). Antifungal 3- hydroxyl fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Applied and Environmental Microbiology, 69, Hassan, Y.I., Bullerman, L. B. (2008) Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp. tolerans isolated from a sourdough bread culture. International Journal Food Microbiology, 121, Corsetti, A., Gobbetti, M., Rossi, J., & Damiani, P. (1998). Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., & Gobbetti, M. (2000). Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Applied and Environmental Microbiology, 66, Gerez, C.L., Torino, M.I., Rollán, G., de Valdez, G.F. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties, Food Control (2008), doi: /j.foodcont Garrote, G.L. (1999) Bacterias Lácticas y Levaduras para la Industria Alimentaria: Kefir. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas, Departamento de Química- Departamento de Ciencias Biológicas. Onilude, A. Fagade, O. Bello, M. y Fadahunsi, I. (2005). Inhibition of aflatoxin – producing aspergilli by lactic acid bacteria isolates from indigenously fermented cereal gruels. African J.Biotech. 12, Molina, M. Giannuzzi, L. (1999) Combined effect of temperature and propionic acid concentration on the growth of Aspergillus parasiticus. Food Research International, 32, Magnusson, J. Schnürer, J. (2001) Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis Strain Si3 Produces a Broad-Spectrum Proteinaceous Antifungal Compound. Applied and Environmental Microbiology 67 (1), 1-5. Golowczyc, M. Gugliada, M. Hollman, A. Delfederico, L. Garrote, G. Abraham, A. Semorile, L. De Antoni, G.(2008) Characterization of Homofermentative lactobacilli isolated from kefir grains: potential use as probiotic. Journal of Dairy Research, 75, 1-7.
20 MUCHAS GRACIAS!!!
21 INHIBICIÓN A.flavus AFUBA5 MEDIANTE SLC : GRANULOS KEFIR CIDCA AGK1 y AGK2 CULTIVADOS EN LECHEIIKD- K2 IILag –K2 IIKD- K1 IILag -K1 20º, º,3.3 20º,3.0 30º,3.5 30º,3.3 30º, º,3.5 37º, º,3.0 ¿Papel de las Bacterias ácido lácticas y metabolitos de la fermentación ácido láctica del Kefir en la inhibición fúngica?