1 Estudio Virológico por PCR en tiempo realDiagnóstico Molecular de Herpes virus MSc. Mónica Cappetta Lab. Biología Molecular, AEPSM

2 Biología Molecular en la ClínicaLos métodos moleculares han potenciado la capacidad de los laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en profundidad. Las aplicaciones incluyen: detección cualitativa y cuantitativa genotipado y detección de subtipos testeo de resistencia molecular Cuando se aplican estas metodologías selectivamente en un laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los pacientes.

3 Agentes Virales Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos: - Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos. - Eliminación del cultivo viral altamente complejo. - Rápido diagnóstico de infecciones virales. - Alta sensibilidad y especificidad

4 Familia Herpes virus Infección – latencia – reactivaciónPrincipal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe. Infección – latencia – reactivación 25 tipos infectan al hombre. Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8. Virus envueltos de ADN doble cadena. Se clasifican por su localización en el estado latente.

5 Propiedades de los virus Herpes humanosTipo Nombre Sub Familia Células blanco Latencia Transmisión 1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio Neurona Contacto cercano Contacto sexual Madre-bebé 2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Contacto cercano Contacto sexual 3 Varicella Zoster virus (VSV) Contacto 4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gamaherpesvirinae Linfocito B, epitelio Linfocito B Saliva, ruta respiratoria 5 Cytomegalovirus (CMV) Betaherpesvirinae Epitelio, monocitos, linfocitos Monocitos, linfocitos y otros Secreciones, transfusión sangre, transplan-te, congenita 6 Herpes lymphotropic virus Linfocitos T y otros Contacto, ruta respiratoria 7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Desconocido 8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Cél. endoteliales Intercambio de fluido corporales?

6 Manifestaciones clínicasHSV 1 y 2: Lesiones VZV: varicela (niños) herpes zoster (adultos/react.) EBV: Asintomático (niños) Mononucleosis (jóvenes/adultos) CMV: asintomático Complicaciones Encefalitis (HSV, VZV) Neumonia (VZV) Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV) Infección congénita (VZV, CMV) Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)

7 Diagnóstico Molecular de Herpes virusEncefalitis virales : estudio de LCR Pacientes inmunodeprimidos

8 Herpes virus y encefalitisAgente causal de infecciones SNC (10% encefalitis virales) 70% tasa mortalidad diagnóstico precoz - terapia antiviral morbilidad/moratlidad 20% en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR

9 Reactivación en inmunodeprimidosEjemplo Citomegalovirus: Las pruebas serológicas presentan un uso limitado: - individuos con infección latente - anticuerpos aparecen 2 semanas después de la infección aguda Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc. La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar esta reactivación. Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.

10 LCR Orina Plasma Biopsia ADN PCR 1er. round 2do. round 2n copias DNAProducto nested-PCR Electroforesis en gel

11 Diagnóstico por real time-PCRDetección rápida. Detección cualitativa y cuantitativa. No requiere manipulación post-PCR. Menor probabilidad de contaminación o errores de manipulación.

12 Implementación en el laboratorioDetección cualitativa de familia Herpes virus en LCR por PCR en tiempo real: - Entrega de resultados en unas horas Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo real: - Seguimiento de pacientes con reactivación - Evaluación de tratamientos

13 Detección cualitativa de familia Herpes por Real time3 Reacciones de amplificación: HSV / CMV EBV / HHV-6 VZV 6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación. Detección por Sybergreen Tm específica Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación en el laboratorio del protocolo. Multiplex

14 La Tm puede variar para: Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y el contenido de GC. La Tm puede variar para: - Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC - Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución de GC diferente - Productos que difieran en 1 o más bases. Análisis: Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta. Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).

15 Análisis de Tm de los productos amplificadosVZV HHV6 EBV

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21 Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real PCR24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación Utilización de Kit comercial Costos más elevados

22 Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real PCR24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación Áreas pre y post-amplificación físicamente separadas Cabina de UV

23 Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación PCR tiempo real 2-3 hrs LightCycler Poca manipulación Riesgo de contaminación Multiplex con Sybergreen Menor costo que Kit comercial

24 MUCHAS GRACIAS !!