1 Fisiología del Sistema Nervioso 2006Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevis Dra. Eleonora Katz Dra. Paola Plazas Se realiza el viernes 7 de abril de 9.30 a 13 hs y de 14 a hs en el INGEBI: Vuelta de Obligado 2490.

2 Procedimiento a9 1. Preparación4. Registro de corrientes iónicas con TVC 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

3 1. Preparación de cRNA Amplificación del plásmido LB + ampicilina

4 Purificación del Plásmido (lisis alcalina)1. Tris+EDTA (pH 8) + Rnase A 2. NaOH + SDS sobrenadante 3. Kac (frío) Buffer de lavado Plásmido ssDNA Restos células KDS Lavado EtOH + DNA se redisuelve

5 Tratamiento con Proteinasa K Extracción con Fenol-cloroformoLinealización y preparación del templado X SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTR inserto Tratamiento con Proteinasa K + Extracción con Fenol-cloroformo Templado para transcripción in vitro

6 Transcripción in vitroRNA pol SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTR inserto AAAAAAAAAAAA T7 RNApol rATP;rCTP;rUTP:rGTP CAP Buffer

7 Geles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNAPurificación del plásmido Digestión con Nhe I Síntesis de cRNA

8 Procedimiento a9 1. Preparación4. Registro de corrientes iónicas con TVC 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

9 Remoción quirúrgica de los oocitos2. Aislamiento de los oocitos Anestesiadas con ácido 3-aminobenzoico etil éster Remoción quirúrgica de los oocitos

10 Pueden observarse los oocitos en distintos estadios de desarrolloLóbulos abiertos Pueden observarse los oocitos en distintos estadios de desarrollo Lóbulos ováricos Polo animal Polo vegetal Los lóbulos estan formados por oocitos rodeados de tejido conectivo altamente irrigado (gran cantidad de vasos sanguíneos).

11 Se eliminan las células folicularesDiámetro del oocito: 1-1.2mm

12 Procedimiento a9 1. Preparación4. Registro de corrientes iónicas con TVC 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

13 3. Inyección del cRNA a los oocitos

14 Biosíntesis de la proteína de interés a partir del cRNA por el oocito5’UTR 3’UTR AAAAAAAAAAAA

15 Expresión de receptores nAChR a9a10 en la membrana del oocito… luego de 3 días

16 Procedimiento a9 1. Preparación4. Registro de corrientes iónicas con TVC 3. Inyección de cRNA a9 2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 mM

17 4. Registro de corrientes iónicas con TVC

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19 Canales endógenos del oocitoICl activada por Ca2+ (expresión elevada) Ca2+ Cl - BAPTA Canales activados por estiramiento (expresión elevada) receptores mACh (muscarínicos) Canales de K+ activados por Ca2+ (expresión baja)

20 El receptor nicotínico a9a10Elgoyhen et al. 1994 a10 a9 1960s -1990s AChR ? Elgoyhen et al. 2001

21 El receptor colinérgico nicotínico a9a10 es una canal iónicoK+ K+ K+ ACh Vsostén = -70mV Na + Ca2+

22 Trabajo en el laboratorio1. Inyeccción del cRNA de interés a los oocitos (mostración) 2. Fijación de voltaje con dos microelectrodos en oocitos control e inyectados con cRNA de las subunidades nAChR a9 y a10 3. Registro de corrientes evocadas por ACh 4. Efecto de la nicotina 5. Evaluación de la permeabilidad al Ca2+ del nAChR a9a10 por la activación secundaria de la corriente de cloro activada por Ca2+ en soluciones extracelulares con y sin Ca2+.