1 Fundamentos de la Extracción de ADNI Taller de Técnicas Moleculares Fundamentos de la Extracción de ADN M.C. Arturo Muñoz Pérez Cd. Obregón, Sonora a 26 de mayo de 2015

2 Unidad fundamental de todos los organismos vivosLa Célula Unidad fundamental de todos los organismos vivos Animales Microorganismos Plantas

3 ¿Cuáles son las diferencias?Tipos de células Las células se clasifican en dos grandes grupos: Eucariotas Procariotas ¿Cuáles son las diferencias?

4 ÁCIDOS NUCLÉICOS

5 Ácidos Nucleicos Son moléculas esenciales para las funciones de la célula y constituyen el material genético de los organismos. Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico (ADN) (ARN)

6 Nucleótidos Monómeros de los ácidos nucleicos, están compuestos por los siguientes tres elementos: Base nitrogenada (5 diferentes) Azúcar pentosa Grupo Fosfato

7 Bases nitrogenadas La información genética esta almacenada con un código formado por cuatro bases químicas. Las bases nitrogenadas están divididas en dos grupos: Purinas Pirimidinas ADN Guanina Adenina Timina Citosina ARN Uracilo

8 Ensamblaje de ADN Enlace fosfodiéster

9 Apareamiento de bases Los nucleótidos se enlazan por medio de puentes de hidrógeno para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos. Un átomo de hidrógeno de una molécula es atraído a un átomo electronegativo especialmente nitrógeno, oxígeno, y otra molécula

10 Estructura de ADN

11 EXTRACCIÓN DE ADN

12 Extracción de ADN Protocolo de Raeder & Broda, 1985.La extracción y purificación del ADN es el paso inicial y básico para realizar trabajos en biología molecular.

13 Consideraciones para una buena extracciónCantidad de ADN Remoción de inhibidores Remoción o inhibición de nucleasas Maximizar la calidad de ADN

14 Proceso 1. Obtención de muestra 2. Extracción y purificación3. Cuantificación 4. Calidad 5. Conservación

15 I. OBTENCIÓN DE MUESTRA

16 Obtención de muestra

17 II. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

18 Fenol-Cloroformo Es un método de extracción líquido-líquido. Se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructurar subcelulares mediante el empleo de detergentes con lo posterior eliminación de las proteínas y lípidos con solventes orgánicos.

19 Solución de extracciónLa solución de extracción esta formado por 200 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 250 mM EDTA, 0.5 % SDS Nos ayuda a: Disolver membranas celulares Inactivar ADNasas y RNAsas Remoción de contaminantes

20 EDTA

21 NaCl Proporciona iones Na+ que bloquean la carga negativa del fosfato del ADN. Esta negatividad en el ADN provoca que las moléculas se repelen unas a otras. Los iones Na+ forman un puente iónico con los grupos fosfatos, neutralizando las cargas y permitiendo una mayor afinidad entre las moléculas de ADN

22 SDS Detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas y solubiliza la membrana celular

23 Precipitación de ADN El ADN es altamente insoluble en isopropanol, este se disuelve en agua para inducir a que el ADN tenga un cambio estructural en la solución, se junte y precipite.

24 III. CUANTIFICACIÓN

25 Cuantificación de ADN La cuantificación de ADN se realiza mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm. La pureza es evaluada por la tasa de absorbancia de 260 nm y 280 nm. Un ADN de buena calidad es aquel que su relación es de 1.7 a 2.0

26 IV. CALIDAD

27 Prueba de calidad ElectroforesisEs una técnica de separación de moléculas en una mezcla por la aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa

28 Elementos de la electroforesisCámara de electroforesis Gel de agarosa (1 – 2 %) Buffer Buffer de carga Transiluminador Marcador peso molecular

29 Prueba de calidad Las biomoléculas poseen una carga eléctrica (ADN negativa), estas se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.

30 Prueba de calidad

31 V. ALMACENAMIENTO DE ADN

32 Conservación de ADN El ADN se mantiene en congelación (-80 °C) hasta su empleo. A menor temperatura la preservación se prolonga y múltiples descongelaciones ocasionan una degradación progresiva, por lo que es recomendable hacer alícuotas.

33 PRÁCTICA DE LABORATORIO

34 Práctica de LaboratorioPROTOCOLO EXTRACCIÓN DE ADN HONGOS Cheng & Jian, 2006 Colocar 100 mg de micelio fresco en un tubo eppendorff de 1.5 mL Agregar 500 µL de buffer de extracción Resuspender el pellet celular Mezclar el vórtex durante 5 min Añadir 350 µL de fenol (4 °C), mezclar en vórtex 30 seg Centrifugar a rpm durante 10 min Agregar 1 volumen de cloroformo y mezclar en vortex 30 seg Tomar la fase acuosa Centrifugar durante 30 min a rpm a 4 °C Añadir 150 µL de cloroformo, mezclar en vórtex 30 seg Transferir la fase acuosa y agregar 0.6 volúmenes de isopropanol Homogenizar por inversión y centrifugar 5 min a 13,000 rpm. Descartar sobrenadante Lavar pellet con 500 µL de etanol al 70 % 2x Centrifugar a 13,000 g por 2 min a 4 °C y descartar sobrenadante Almacenar a -20 °C Secar pellet y resuspender en 40 – 70 µL de H2O MQ

35 Práctica de LaboratorioGEL DE ELECTROFORESIS VISUALIZACIÓN DE ADN Preparar la cámara de electroforesis, llenándola con TAE 1X Preparar gel 30 g agarosa/ 30 mL TAE 1X Calentar en microondas Una vez enfriado, agregar 1.2 µL de intercalante Gelred y mezclar Visualizar en UVIdoc Correr las muestras de ADN a 80 V durante 30 min Cargar 5 µL de ADN y mezclar con 1 µL de buffer de carga Verter sobre el portagel y colocar peines Interpretar resultados

36 GRACIAS POR SU ATENCIÓN