1 Generación y Caracterización de una Proteína de Fusión Basada en el Autoantígeno MUC16 Generation and Characterization of a Fusion Protein Based on the Autoantigen MUC16 Benavente, B. 1., Meza, C. 1., Saavedra-Venegas, C. 1., Saavedra, P. 1., Toledo, J.R. 1., Laboratorio de Biotecnología y Biofármacos 1,Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad De Concepción. RESUMEN La Mucina 16 (MUC16) es una proteína tipo mucina altamente glicosilada y sobreexpresada en más del 80% de pacientes con cáncer de ovario. Diversos estudios relacionaron esta sobreexpresión con funciones biológicas vinculadas a la progresión tumoral; modulando el crecimiento de células cancerígenas, la motilidad celular, invasión e inmunosupresión. Diversas estrategias terapéuticas han utilizado a MUC16 como un auto-antígeno, incluyendo algunas modalidades inmunológicas basadas en anticuerpos, las cuales han obtenido resultados heterogéneos reflejando la necesidad de continuar con la búsqueda de nuevos enfoques. Una estrategia atractiva, es el uso del par co- estimulador CD40/CD40L, cuya señalización cumple un rol fundamental en procesos inmunes esenciales como en la inducción de respuestas citotóxicas frente a células tumorales. Durante nuestro trabajo, se generaron y caracterizaron las proteínas controles rMUC16 y rCD40L, que consisten en el dominio C-terminal de las regiones extracelulares de ambas moléculas. Mediante estrategias moleculares, se generaron vectores adenovirales para las respectivas proteínas, los cuales se amplificaron en la línea celular complementaria HEK293A. Las proteínas fueron expresadas en la línea celular SiHa mediante transducción adenoviral y fueron caracterizadas mediante electroforesis SDS-PAGE y Western-blot. Estos resultados nos permitirán desarrollar una proteína de fusión basada en MUC16/CD40L para ser utilizada en una formulación vacunal que permita determinar los niveles y persistencia de la respuesta inmune frente a MUC16 en modelos murinos. INTRODUCCIÓN El Antígeno de Cáncer 125, o también conocido como CA125, es un marcador sérico que se utiliza rutinariamente en la práctica ginecológica para monitorear la evolución del cáncer de ovario y corresponde al epítope repetitivo de la Mucina 16 (MUC16), molécula que cumple un rol activo en varios procesos que favorecen la progresión de esta enfermedad. El cáncer de ovario es la malignidad ginecológica que presenta la mayor tasa de mortalidad. Esto refleja, en parte, la ausencia de síntomas tempranos y la falta de pruebas de detección eficaces. Por lo tanto, el cáncer de ovario a menudo se diagnostica en una etapa avanzada, después de que se ha extendido más allá del ovario (enfermedad avanzada), en donde presenta una tasa de supervivencia de 5 años que va desde el 20% al 30% [1][2]. Por desgracia, a pesar de los avances logrados en los últimos años, la proporción de pacientes que logran revertir este cáncer sigue siendo baja. Por esta razón, el desarrollo de nuevas terapias que puedan mejorar la tasa de supervivencia sigue siendo un imperativo. Durante las dos últimas décadas, se han realizado numerosos ensayos clínicos en cáncer de ovario utilizando modalidades inmunológicas [3]. Los resultados para estas estrategias han sido heterogéneos, lo que demuestra la necesidad de un enfoque reflexivo e integrador para examinar el papel de la inmunoterapia en esta enfermedad. Como alternativa terapéutica se presenta el uso de la señalización del par inmuno-estimulante CD40-CD40L combinado con MUC16 que permita levantar una respuesta inmune potente y específica frente a este antígeno. OBJETIVO Generar las proteínas recombinantes rMUC16 y rCD40L mediante sistemas de transducción adenoviral, que permitirá desarrollar una proteína de fusión basada en MUC16/CD40L para futuras evaluaciones de inmunogenicidad en modelos murinos. RESULTADOS CONCLUSIÓN REFERENCIAS METODOLOGÍA 1.Generación de los vectores adenovirales pAd-rMUC16 y pAd-rCD40L. La generación de genomas adenovirales se hizo utilizando el sistema AdEasy™ Vector System (Quantum Biotechnologies, EE.UU). La presencia de viriones infectivos se evidencia por la formación de halos de lisis alrededor de las células infectadas mediante observación directa de dispersión del color verde en las células expuestas a la luz ultravioleta en el microscopio óptico de fluorescencia (OLYMPUS IX81, Japón). 2.Expresión de proteínas rMUC16 y rCD40L. La expresión de las proteínas rMUC16 / rCD40L se realizó en la línea celular SiHa (ATCC® HTB­35™), mediante la transducción adenoviral de cultivos. Transcurridas 72 hrs, se colectó el medio y se almacenó a -20ºC para posteriores análisis. 3.Análisis de expresión. La electroforesis de proteínas (SDS-PAGE 10%) y la inmuno- transferencia utilizando una membrana de PVDF (Fluoruro de polivinilideno), se realizaron mediante el protocolo establecido por Burnett (1981) [4]. 1. Diseño de vectores2. Ad-Easy System Figura 3. Amplificación de los vectores adenovirales en la línea celular complementaria HEK-293A. Paneles A: campo claro, Paneles B: Fluorescencia GFP; panel 1A- 1B: control de células HEK-293A; panel 2A-2B: 24 hrs post transducción; panel 3A-3B: 48 hrs post transducción; panel 4A-4B: 72 hrs post transducción. La observación se realizó en el microscopio de fluorescencia (OLYMPUS IX81, Japón) aumento 100X Figura 4. Células SiHa transducidas con vectores adenovirales. A: Campo Claro; B: Fluorescencia GFP; 1A-B: fotografía realizada al control de células SiHas (células sin transducir); 2A-B: fotografía realizada 24 hrs. post transducción; 3A-3B: fotografía realizada 96 hrs. post transducción La observación se realizó en el microscopio de fluorescencia (OLYMPUS IX81, Japón) con un aumento 100X. 4. Expresión de proteínas recombinantes3. Generación de vectores virales [1] U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, National Cancer Institute,. (2014). A Snapshot of Ovarian Cancer. [2] Rauh-Hain, J., Olawaiye, A., & Krivak, T. (2011). Ovarian Cancer Screening and Early Detection in the General Population. Reviews In Obstetrics And Gynecology, 4(1), 15-21. [3] Chu CS, Kim SH, June CH, Coukos G. (2008). Immunotherapy opportunities in ovarian cancer. Expert Rev Anticancer, 3(8), 243-257. [4] Burnette, W. (1981). “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry, 112(2), 195-203. Carril 1: proteínas precipitadas del medio de cultivo de células transducidas a las 96 hrs con el vector adenoviral pAd-CA125his. Carril 2: Patrón de peso molecular, Carril 3: FSHhis recombinante, Carril 4: proteínas precipitadas del medio de cultivo de células no transducidas. 5. Análisis de expresión de rMUC16 Figura 5. Análisis de la expresión de rMUC16 en la línea celular SiHa. Panel A: SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Coomasie; Panel B: Western blot, utilizando un anticuerpo anti-His en una dilución 1/3000, seguido de un anti-ratón en una dilución 1/6000. 6. Análisis de expresión de rCD40L Figura 6. Análisis de la expresión de rCD40L en la línea celular SiHa. Panel A: SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Coomasie; Panel B: Western blot, utilizando un anticuerpo anti-CD40L en una dilución 1/1000, seguido de un anti- conejo en una dilución 1/5000. Carril 1: células HEK293 transfectadas a las 96hrs con el vector pAd-Track-rMUC16, Carril 3: proteínas precipitadas del medio de cultivo de células no transfectadas, Carril 4: proteínas precipitadas del medio de cultivo de células transfectadas con pAd- Easy-rCD40L Patrón de peso Molecular, Carril 2: proteínas precipitadas del medio de cultivo de Figura 1. Diseño de vectores. En los paneles A, B y C, se muestra el vector de transferencia pAdTrack del Sistema AdEasy con los respectivos genes de interés. En el Panel A, se muestra el vector pAdTrack-rMUC16; en el Panel B, se muestra el vector pAdTrack-rCD40L; y en el Panel C, el vector pAdTrack-rMUC16/CD40L Figura 2. Diagrama explicativo del Sistema AdEasy. El sistema AdEasy se basa en la co-transformación del vector de transferencia pAdTrack con el vector pAdEasy, que cuenta con parte del genoma adenoviral, para la generación de un plásmido pAd-Recombinante que es transfectado de forma lineal a la línea celular complementaria HEK293A para la formación de viriones virales. El uso de la tecnología de vectores virales recombinantes, permite la generación de viriones infectivos capaces de producir proteínas de interés en cultivo de células de mamíferos. La producción de las proteínas rMUC16 y rCD40L es la base para la generación de la proteína de fusión rMUC16/CD40L. Estas moléculas serán utilizadas para determinar los niveles de respuesta inmune humoral y celular en modelos murinos, y evaluar la asociación sinérgica del antígeno MUC16 con la molécula moduladora del sistema inmune, CD40L.