1 GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA...... CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA

2 CÓDIGO GENÉTICO DNA Doble HéliceHebra codificadora DNA Doble Hélice 5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3' Hebra no codificadora 3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5' Retrotranscripción TRANSCRIPCIÓN mRNA 5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3' TRADUCCIÓN Proteína (NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)‏

3 GENES Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos.Un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica. Por ejemplo: Proteínas, ARNm, ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN pequeños.

4 GEN PROCARIOTA

5 mRNA POLICISTRÓNICOS

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7 GEN EUCARIOTA

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10 GENOMAS El genoma es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular. EUCARIOTAS CROMOSOMA MITOCONDRIAS CLOROPLASTOS

11 GENOMA HUMANO 3200 MB

12 Amphibians 109–1011 Psilotum nudum 2.5 x 1011Organismo Tamaño Genoma(pares de bases)‏ Fago λ ×104 Escherichia coli ×106 Levadura ×107 Caenorhabditis elegans 8×107 Drosophila melanogaster 2×108 Humano ×109 Amphibians 109–1011 Psilotum nudum 2.5 x 1011

13 C-value enigma ó C-value paradoxEl C-value enigma ó C-value paradox es un término usado para describir la variación en los tamaños de genomas nucleares entre las especies eucariotas. El objeto de estudio del C-value enigma es la observación de que el tamaño del genome no se correlaciona con la complejidad del organismo.

14 EJERCICIO Hacer un programa que a partir del archivo MTtabaco.gbk que contiene el genoma mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida el usuario con 1000nts upstream y 1000nts downstream y guardarlo en formato fasta. Especificaciones del formato Genbank. efinitions/feature_table.html Especificaciones del formato Fasta. rmat

15 LOCUS BA000042 430597 bp DNA circular PLN 02-MAY-2006DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome. ACCESSION BA AP AP006341 VERSION BA GI: KEYWORDS . SOURCE mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco)‏ ORGANISM Nicotiana tabacum Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae; Nicotianeae; Nicotiana. REFERENCE 1 AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M., Makita,N., Yagura,S., Hirai,A. and Sugiura,M. TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), (2005)‏ PUBMED REFERENCE 2 (bases 1 to )‏ AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi , Japan Tel: , Fax: )‏ FEATURES Location/Qualifiers

16 /db_xref="GI: " /translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCALN TKLGQRCEGL" gene complement( )‏ /gene="atp6" CDS complement( )‏ /note="CDS is reported in Acc# X06595" /codon_start=1 /product="ATP synthase F0 subunit 6" /protein_id="BAD " /db_xref="GI: " /translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLFM LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQKFS PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLCMN DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ KRV" gene complement( )‏ Formato Genbank

17 ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc 61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg 241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc 421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc 601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta ctctactagt 721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct 781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa Formato Fasta >gi|142864|gb|M |BACDNAE B.subtilis dnaE gene encoding DNA primase, complete cds GTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGC AGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGT CCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCT GCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTC TCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAG TCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAA ATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGA ATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGT GAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCA GAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGCAGGGCTCTTGG

18 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTELas técnicas más importantes: - Clivado del ADN en sitios específicos por enzimas de restricción. - Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot, Northern blot, hibridación in situ y Western blot. - Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado. - PCR, reacción en cadena de la polimerasa.

19 MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITRO ENZIMAS DE RESTRICCIÓN- Permiten realizar cortes en sitios específicos en el ADN, que permiten aislar y manipular genes individuales. - Son endonucleasas (cortan enlaces internos de la molécula) de origen bacteriano. - Reconocen secuencias específicas de ADN de diferente longitud. - Luego del reconocimiento realizan el corte.

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22 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN- Existen alrededor de 4000 enzimas de restricción conocidas. - 671 disponibles comercialmente. - Hay bases de datos de enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento y corte: REBASE

23 RESTRICCIÓN EN 2 PASOS from Bio import Restriction from Bio import Seqfrom Bio.Alphabet import IUPAC an=Restriction.Analysis(Restriction.CommOnly, Seq.Seq\ (secuencia, IUPAC.unambiguous_dna))‏ an.print_as ("map")‏ Resultado (output): 7 TspEI Sse9I Tsp509I FokI | | HpyCH4V CviRI | | | | BstF5I BseGI | | | ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG ||||||||||||||||||||||||||| TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC

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25 HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble hélice se llama hibridación, dado que puede utilizarse para formar ADN híbrido compuesto por cadenas de diferentes orígenes. - La hibridación permite la formación de complejos DNA:DNA y ADN:ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G). - El fenómeno de hibridación ocurre bajo condiciones especiales en solución (pH, concentración de sales, T0, etc). 5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3' 5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'

26 Cortado por enzimas de restricciónTÉCNICAS BÁSICAS DNA Cortado por enzimas de restricción RNA PROTEÍNA ELECTROFORESIS Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados por electroforesis a membranas sintéticas. TRANSFERENCIA Hibridación del DNA o RNA con secuencias marcadas con radiactivo (“sondas”). Revelado por radioautografía. Detección de Proteínas con anticuerpos marcados. REVELADO RESULTADOS Southern blot Nouthern blot Western blot

27 HIBRIDACIÓN IN SITU

28 CLONADO MOLECULAR Introducción en una célula húesped de una mólecula de ADN capaz de replicarse en paralelo con el genoma del húesped en estado episomal, es decir sin integrarse al genoma.

29 VECTORES DE CLONADO BACTERIÓFAGO O “FAGO” PLÁSMIDOS

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31 PCR

32 TM temperature meltingDNApol de bacterias termofilas Diseño de primers 15-30 nts

33 MUESTRAS

34 USOS DE LA PCR Huella genética Test de PaternidadDiagnóstico de enfermedades hereditarias Clonación de genes Mutagénesis Análisis de ADN fósil Genotipado de mutaciones específicas Identificación de especies

35 Referencias Molecular Biology of The Cell. Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998. Lic. Virginia González