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2 Optimización de los componentes del medio de cultivo para la producción de proteínas heterólogas en Pichia pastoris Autores: José M. Pais Chanfrau a *, Luis E. Trujillo Toledo b Julio 2016 a Carrera de Ingeniería en Biotecnología, FICAYA, Universidad Técnica del Norte (UTN), Ibarra, Imbabura, Ecuador. b Grupo de Investigación en Biotecnología Industrial y Bioproductos, Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE), Quito, Pichincha, Ecuador.

3 INTRODUCCION Pichia pastoris, es una levadura metilotrófica fácil de manipular genéticamente, capaz de crecer en medios químicamente definidos hasta altas densidades celulares y de secretar, de manera eficiente, una amplia gama de proteínas heterólogas, lo que la convierte en un sistema de expresión muy atractivo para la producción a gran escala de numerosas proteínas de uso medico e industrial. http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/ 10.1186/1475-2859-5-39

4 INTRODUCCION ProductCompanyUse Kalbitor® (DX-88 ecallantide, a recombinant kallikrein inhibitor protein) Dyax (Cambridge, MA) Hereditary angioedema treatment Insugen® (recombinant human insulin) Biocon (India)Diabetes therapy Medway (recombinant human serum albumin) Mitsubishi Tanabe Pharma (Japan) Blood volume expansion Shanvac ™ (recombinant hepatitis B vaccine) Shantha/Sanofi (India) Hepatitis B prevention Shanferon™ (recombinant interferon-alpha 2b) Shantha/Sanofi (India) Hepatitis C & Cancer treatment Ocriplasmin (recombinant microplasmin) ThromboGenics (Belgium) Vitreomacular adhesion (VMA) treatment Nanobody® ALX-0061 (recombinant anti-IL6 receptor single domain antibody fragment) Ablynx (Belgium) Rheumatoid arthritis treatment Nanobody® ALX00171 (recombinant anti-RSV single domain antibody fragment) Ablynx (Belgium) Respiratory syncytial virus (RSV) infection treatment ProductCompanyUse Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) Trillium (Canada) Treatment of interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) treatment Purifine (recombinant phospholipase C) Verenium/DSM (San Diego, CA/Netherlands) Degumming of high phosphorus oils Recombinant trypsin Roche Applied Science (Germany) Digestion of proteins Recombinant collagen Fibrogen (San Francisco, CA) Medical research reagents/dermal filler AQUAVAC IPN (recombinant infectious pancreatic necrosis virus capsid proteins) Merck/Schering Plough Animal Health (Summit, NJ) Vaccines for infectious pancreatic necrosis in salmon Recombinant phytase Phytex, LLC (Sheridan, IN) Animal feed additive Superior Stock recombinant nitrate reductase The Nitrate Elimination Co. (Lake Linden, MI) Enzyme-based products for water testing and water treatment Recombinant human cystatin C Scipac (United Kingdom) Research reagent http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/ Algunas de las más de 70 proteínas recombinantes terapéuticas y para el diagnóstico expresadas en P. pastoris aprobadas por la USFDA

5 INTRODUCCION Mediante un estudio en cultivo continuo de la levadura metilotrófica Pichia pastoris, Wegner (1983) determinó los rangos de concentración de los elementos químicos necesarios para un medio de cultivo. Wegner GH (1983) Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities. Patent US4414329. AtomsRange Macro Elements [g·L -1 ] P2,2 – 10,0 K1,5 – 10,0 Mg0,3 – 1,2 Ca0,08 – 0,8 S0,2 – 5,0 Trace Elements [mg·L -1 ] Fe9,0 – 80,0 Zn3,0 – 40,0 Cu1,0 – 10,0 Mn0,9 – 8,0

6 INTRODUCCION (1)Wegner GH (1983) Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities. Patent US4414329. (2)Pichia Fermentation Process Guidelines. 2002, (Version B 053002). Invitrogen Co. p. 11. (3)Stratton J, Chiruvolu V, Meagher M, High cell- density fermentation, in Methods in molecular biology: Pichia protocols, DR Higgins and JM Cregg, Ed.. 1998, Humana, Totowa: N.Y. p. 107- 120. (4)D’Anjou M, Daugulis AJ, A model–based feeding strategy for feed-batch fermentation of recombinant Pichia pastoris. Biotechnol. Tech., 1997. 11: p. 865-868. Atom Wegner (1)BSM (2)FM22 (3)Daugulis et al. (4) Macro Elements [g·L -1 ] N -NH 4 OH (pH control) 1,06 +NH 4 OH (pH control) 4,24 P2,2 – 10,07,170,982,73 K1,5 – 10,011,041,233,44 Mg0,3 – 1,21,470,310,46 Ca0,08 – 0,80,270,070,10 S0,2 – 5,05,560,460,66 Trace Elements [mg·L -1 ] Fe9,0 – 80,056,8365,05 Zn3,0 – 40,041,7322,66 Cu1,0 – 10,06,647,61 Mn0,9 – 8,04,244,87 Na - 0,220,95 I - 0,291,61 Mo - 0,351,98 B - 0,0150,09 Co - 0,99-- Cl - 46,45173,29 pH Control- NH 4 OH & H 3 PO 4 KOH & H 3 PO 4

7 PROBLEMA CIENTIFICO A pesar del éxito obtenido con la utilización de estos medios, se observa una turbidez de coloración blanca después de la esterilización y el ajuste del pH ≥ 5, lo que indica la precipitación y desbalances en la composición del medio de cultivo.

8 HIPOTESIS Es posible diseñar un medio de cultivo a partir de los estudios de Wegner (1983), la solubilidad y precio unitario de cada componente del medio de cultivo, donde se eliminen los desbalances observados con los medios tradicionales, a un costo mínimo.

9 RESULTADOS

10 RESULTADOS Y DISCUSION El medio MBSM propuesto resuelve el problema del desbalance de los anteriores medios y requiere un 27% menos masa total de reactivos en su preparación, que el medio más simple reportado (Daugulis et al.) lo que impacta favorablemente sobre el medio ambiente y la economía global del proceso.

11 DISCUSION 1.Pais JM, García Y, Licor L, Besada V, Castellanos-Serra L, Cabello CI, Hernández L, Mansur M, Plana L, Hidalgo A, Támbara Y, Abrahantes-Pérez MC, Toro Y, Valdés J, Martínez E (2004) Improving the expression of mini-proinsulin in Pichia pastoris. Biotech Lett 26: 1269–1272. 2.Trujillo LE, Banguela A, Pais JM, Támbara Y, Arrieta JG, Sotolongo M, Hernández L (2002) Constitutive expression of enzymatically active Gluconacetobacter diazotrophicus levansucrase in the methylothrophic yeast Pichia pastoris. Afinidad 59:365-370. 3.Trujillo LE, Banguela A, Pais JM, Támbara Y, Sotolongo M, Arrieta JG, Hernández L (2003) Expression of enzymatically active Gluconacetobacter diazotrophicus levansucrase in Pichia pastoris under the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter. Biotecnol Aplicada 20:192-200. 4.Menéndez C, Hernandez L, Banguela A, Pais JM (2004) Functional production and secretion of the Gluconoacetobacter diazotrophicus fructose-releasing exo-levanase (LsdB) in Pichia pastoris. Enz Microbial Technol 34: 446-452. 5.Menéndez C, Hernández L, Pais JM, Banguela A, Ramírez R, Trujillo LE, Alfonso D, Arrieta JG (2005) Identification and recombinant expression of a bacterial exolevanase useful for the production of high fructose syrups. Biotecnol Aplicada 22: 68-72. Recombinant ProteinPromoterExpression level / Biomass concentrationRef. Mini-proinsulin, MPIAOX10,3 g·L -1 / 100 g DCW·L -1 at 160 h(1) Levansucrase (LsdA)GAPDH0,2 g·L -1 (4000 EAU·L -1 ) / 90 g DCW·L -1 at 39 h(2,3) Exolevanase (LsdB) AOX1 GAPDH 21,1 EAU·L -1 / 115 g DCW·L -1 at 96 h 26,6 EAU·L -1 / 60 g DCW·L -1 at 39 h (4,5)

12 CONCLUSIONES El medio MBSM propuesto elimina la turbidez blanca observada con la preparación del medio estándar BSM y el medio FM22, lo que sugiere que ninguno de sus cationes divalentes (Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+ ) se acompleja y precipita durante su esterilización y/o posterior ajuste del pH; El medio MBSM es fácil de preparar y no requiere de un orden de adición en sus componentes para su preparación; El medio MBSM es el más económico y el que menos concentración requiere en sus ingredientes, y por tanto, el que menos impacta sobre el medio ambiente.

13 Publicación en SCOPUS - 2016 http://www.omicsonline.com/open-access/optimization-of-culture-medium-for-largescale- production-of-heterologous-proteins-in-pichia-pastoris-to-be-used-in-nanoscience-and- 0974-8369-1000279.php?aid=71576

14 Invitación a Congreso en Phoenix, Arizona, EEUU

15 José Manuel Pais Chanfrau PhD en Ciencias Técnicas (Ingeniería Química) FICAYA – Carrera Ingeniería en Biotecnología [email protected] www.utn.edu.ec GRACIAS