1 HEPATITIS C DESDE EL DIAGNOSTICO EN UN DONANTE DE SANGRE AL TRASPLANTE HEPATICO. NUEVAS TERAPEUTICAS ALFREDO MARTINEZ LABORATORIO DE VIROLOGIA CLINICA CEMIC

2 Un BIOQUÍMICO dona sangre para un amigo y le llega la siguiente carta...SU MUESTRA PRESENTA SEROLOGÌA REACTIVA

3 Tratemos de vivirlo en “carne propia”El mensaje equivocado Tratemos de vivirlo en “carne propia” “Su muestra de sangre fue reactiva para phialophora richarsiae” Infectólogo amigo Se trata de un hongo que produce pústulas, ulceras, ostiomielitis, artritis y meningitis. Las formas diseminadas suelen ser muy serias y potencialmente fatales Experto en micosis En ausencia de síntomas y signos, esta serología tiene 70% de falsos positivos. En el peor de los casos se cura con un antifúngico oral que además no es tóxico ¿Cómo creen que se sentirían entre las 2 consultas?

4 Pensemos ahora en el paciente con hepatitis CLlega la carta: “Su sangre es reactiva.....”) El paciente no está “preparado” para semejante noticia  Desesperado, por fin consigue el número de hospital “El primer turno para el Dr. Smith es el 3 de diciembre. El Dr. García puede verlo en un mes” Sale a “buscar” al primer médico que encuentre En la mayoría de los casos no tienen “suerte”

5 HCV “El virus que creó a la Hepatología”Paul Berk Seminars in Liver Disease (2000)

6 “ES MEJOR SABER DESPUES DE HABER PENSADO Y DISCUTIDO, QUE ACEPTAR LOS SABERES QUE NADIE DISCUTE PARA NO TENER QUE PENSAR” FERNANDO SAVATER

7 AGENDA 1- CICLO DE VIDA DE LA HEPATITIS C – BLANCOS TERAPEUTICOS2- DIAGNOSTICO DE HEPATITIS C 3- NUEVOS TRATAMIENTOS Y RESISTENCIA

8 Historia natural Cronicidad Evolución mayor de 30 añosLenta Evolución Hígado normal Infección aguda Infección crónica Cirrosis en 20% CHC % por año progresión menor de 20 años Rápida

9 Historia Natural de la Hepatitis C HepatoCa 2% Descompensación 5%Hepatitis Aguda C(100) niños jóvenes <1 30 mujeres 70 Curación Fulminante Hepatitis Crónica C ? 20 50 Enfermedades Extrahepáticas ALT normal ALT elevada 1/4 1/4 1/2 5 – 10a 11-30a > 30a CIRROSIS HepatoCa 2% Descompensación 5% Muerte/TxH-4%

10 INGRESO DEL VIRUS (FUSION)

11 REPLICACION DEL RNA HCV

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13 DE LA POLIPROTEINA DE HCVTRADUCCION Y PROCESO DE LA POLIPROTEINA DE HCV

14 ENSAMBLE DE LA NUEVA PARTICULA DE HCV

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16 DIAGNOSTICO DE HEPATITIS C METODOS SEROLOGICOS Y MOLECULARES

17 SCREENING DE HCV: DETECCION DE ANTI HCVELISA: test de screening – Sensibilidad: 97% – Detección de anticuerpos circulantes Valor predictivo positivo – 95% en pacientes pertenecientes a población de riesgo con ALT elevada – 50% en pacientes sin riesgo y ALT normal

18 SCREENING SEROLÓGICO c100-3 1º S 80% CORE E1 E2 NS1 NS2 NS3 NS4 NS5ELISA c200 C22-3 2º 95% c200 NS5 C22-3 3º 97%

19 La Pregunta Inicial Anti-HCV(+) ¿Falso positivo? ¿Verdadero positivo?Transfusiones o drogas IV Incremento de ALT Enfermedad hepática Pacientes sanos No antecedentes parenterales ALT normal Pruebas Suplementarias: RIBA-LIA HCV RNA Anti-HCV(+) ¿Verdadero positivo?

20 Limitaciones del Anti-HCVNo mide la presencia de virus circulante No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas) En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta

21 SCREENING SEROLÓGICO Ag/Ac 4ª Concentración Relativa Infección 10 20Días Infección 10 20 60 80 100 30 40 50 70 90 110 Eclipse Período de Ventana Serológica Anti-HCV 3ra Anti-HCV 2da Anti-HCV 1ra

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24 RIBA/LIA Test suplementario que permite caracterizar los antígenos virales específicos contra los cuales están dirigidos los anticuerpos utilizados en el ELISA ANTIGENOS VIRALES(ESTRUCTURALES Y NO ESTRUCTURALES) ADHERIDOS A UN SOPORTE SÓLIDO (NITROCELULOSA/NYLON)

25 RIBA/LIA •Su aplicación en la clínica es limitada.•Permite confirmar resultados de ELISA de baja relación de positividad o resultados discordantes ELISA positivos con PCR cualitativa no detectable. •Un resultado por RIBA-LIA negativo en pacientes con ELISA positivo indicaría un resultado falso positivo de este último.

26 HCV Ag assay’s LLOD corresponds to HCV RNA levelsHCV Ag CORE Architect® HCV Ag assay (Abbott Diagnostics)  Dynamic range of quantification is 3.0–20,000 fmol/L HCV Ag assay’s LLOD corresponds to HCV RNA levels of 500–3000 IU/mL Annals of Gastroenterology (2013) 26,

27 Annals of Gastroenterology (2013) 26, 146-149

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29 ELISA ANTI HCV MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SONNEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD FALSOS POSITIVOS O BFR

30 CAUSASDE FP INMUNOENSAYOSLa causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no virales contaminantes Vacunación contra FLU o Rabia Infecciones agudas recientes o Alergias Agentes relacionados inmunologicamente

31 HCV-RNA PCR Detección CUALITATIVA de HCV-RNA (suero o plasma)Determina la presencia de RNA del HCV en el suero o plasma (viremia) en pacientes infectados El método es una transcripción reversa y Nested PCR de la región 5’ no codificante del genoma viral El ensayo debe tener una sensibilidad adecuada y conocida contra el standart de OMS Un límite de detección mayor a 50/100 UI/ml, informa como no detectables a pacientes en situaciones críticas como: – Confirmación de la infección y definición de replicación viral. – Valoración de la respuesta virológica temprana intratramiento

32 LIMITE DE DETECCIÓN 50 UI/ml DECISIÓN DE TRATAMIENTOAlgoritmo Diagnóstico ELISA HCV (+) HCV RNA PCR CUALITATIVA CARGA VIRAL HCV ANTICUERPOS RIBA/LIA LIMITE DE DETECCIÓN 50 UI/ml LIMITE DETECCIÓN 10 UI/mL DECISIÓN DE TRATAMIENTO

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34 TERAPIA DE DE HEPATITIS C: PASADO, PRESENTEY FUTURO

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36 ENSAYOS DE LABORATORIO APLICADOS AL TRATAMIENTO DE HCV• Genotipo HCV • HCV-RNA cuantitativo (Carga Viral) • Polimorfismo de IL-28

37 7 genotipos diferentes, que difieren en su secuenciaNUcleotídica en un 25-30% EN UN genotipo se han encontrado diferentes subtipos que son identificados con letras (a, b, c, etc.) marcada distribución geográfica: genotipo 1,2,3 continente americano y europeo genotipo 2 en Japón y China genotipo 4 en Egipto genotipo 5 está circunscripto a Sudáfrica genotipo 6 sudeste asiático fuerte predictor de Respuesta Virológica Sostenida (RVS) en los diferentes regímenes de tratamiento ES IMPORTANTE LA DETERMINACIÓN DE SUBTIPOS YA QUE LA RSV ES DIFERENTE PARA CADA UNO DE ELLOS

38 DETECCION DEL GENOTIPO DE HCVRegión utilizada para la genotipificación: 5’NC La secuenciación directa del genoma: “gold standard” para la determinación del genotipo Las regiones del virus que las diferentes metodologías utilizan para genotipificar son 5’UTR, CORE y NS5B

39 Innolipa METODOS COMERCIALES ENSAYO PROVEEDOR MÉTODO APLICACIÓN REGIONVersant HCV genotype 2.0 assay Siemens Hibridación Reversa Genotipo y algunos subtipos HCV 5’ UTR Trugene genotyping assay Secuenciación directa (Sanger) Genotipo y subtipo HCV 5´UTR Real Time HCV genotype II Abbott Real Time PCR NS5B Innolipa / Linear HCV Array INNOGENETICS PCR + HIBRIDACIÓN REVERSA Genotipo y Subtipo Innolipa

40 CONSIDERACIONES : Se sugiere no utilizar RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) El informe del genotipo debe indicarse de acuerdo a la nomenclatura internacional

41 Mayor Predictor de Respuesta terapéutica : GENOTIPOFactores del paciente • Edad • Sexo • Raza • Peso • Resistencia a Insulina Hígado graso • Salud Mental • Uso de Drogas/alcohol • Cirrosis • Coinfección con HIV • IL28B status Factores del Virus • Genotipo • Carga Viral de HCV RNA

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44 ASPECTOS GENÉTICOS DEL HUÉSPEDGWAS : ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN GENETICA GENOMA HUMANO 3000 MILLONES PB SNPs CADA 300PB 10 MILLONES DE SNPs GEN IL28B : 4 grupos independientes mostraron el rol de la variación genética de un simple polimorfismo

45 Polimorfismos asociados a IL28B: GENOTIPOSrs : T/T T/G G/G rs : C/C C/T T/T rs T/T RVS PEG IFN/RB gen 1 fuerte correlación entre los portadores de este polimorfismo y la RVS en diferentes grupos étnicos. rs C/C CLEARENCE VIRAL ESPONTÁNEO

46 DETERMINACION DEL GENOTIPO DE IL28BMuESTRA : sangre entera Método: extracción dna PCR con primers específicos secuenciación directa MÉTODO COMERCIAL : LightMix® Kit IL28B rs (TIB- Mol biol) comercializado por Roche Diagnostic FRAGMENTO DE 139 pb - ANÁLISIS POR CURVAS DE MELTING ALELO T 51-53°C Y LA VARIANTE C 60°c

47 HCV RNA CUANTITATIVO CARGA VIRAL. FILIPPO ANSALDI et al.World J Gastroenterol 2014 August 7; 20(29):

48 LQ: LIMITE DE CUANTIFICACIÓN ES EL MAS BAJO NIVEL DE HCV RNADETECTABLE Y CUANTIFICABLE LD: LIMITE DE DETECCIÓN ES EL MAS BAJO NIVEL DE HCV RNA DETECTABLE LQ < LD LQ : 25 UI/mL < LD : 15 UI/mL RESULTADO: 20 UI/mL DETECTABLE NO CUANTIFICABLE

49 Tratamientos actualesDe hcv

50 Terapia guiada por la respuesta: enfermos que obtienen respuesta virológica adecuada tempranamente puede acortar su tratamiento sin comprometer la respuesta virológica sostenida (RVS) Reglas de utilidad: la no disminución de la carga viral en los tiempos de control intratratamiento, obligan a la suspensión de la terapia ya que no existen RVS en esos casos. 1. Definir Genotipo: distinguir entre subtipos – Si Genotipo = 2 o 3, PEG-IFN-RBV – Si Genotipo = 1, hacer IL-28B 2. Polimorfismo IL-28B: – Si es favorable, arrancar con PEG-IFN-RBV, ver respuesta a S4 y luego decidir. – Si es desfavorable, Triple Terapia

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52 TRATAMIENTO - BOCEPREVIR

53 DURACIÓN DEL TRATAMIENTO EN PACIENTES NAIVETVP PEG IFN + RBV PEG IFN + RBV (Si S4 Ó S12 ETECTABLE) S4 S12 S24 S48 DURACIÓN DEL TRATAMIENTO EN PACIENTES TRATADOS, RESPUESTA PARCIAL , NULL RESPONSE TVP PEG IFN + RBV S4 S12 S48

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55 IP 2° GENERACION: SIMEPREVIRHCV G1

56 SOFOSBUVIR: PANGENOTIPO

57 SOFOSBUVIR: PANGENOTIPOvs DURACIÓN

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59 EASL 2013 Ivan Gardini

60 MY PERSONAL VIETNAM

61 20 YEARS OF CHRONIC HEPATITSMY PERSONAL VIETNAM 20 YEARS OF CHRONIC HEPATITS 5 TREATMENTS FAIELD 3 CIRRHOSIS 2 LIVER TRANSPLANT

62 A virus that has stolen 20 years of my lifeKidnapping mind, body and spirit

63 NO RE-TRANSPLANT= 24-36 MONTHS LEAVINGFirst transplant, cirrhosis due HCV: December 1997, 34 year old Second transplant, due to HCV recurrency: July 2009, 46 years old Post OLT diagnosis beginning 2011 CHOLESTATIC AND AGGRESSIV HCV RECURRENCY NO RE-TRANSPLANT= MONTHS LEAVING

64 CLINICAL PROFILE beginning 2011PARTIAL RESPONDER IL28 CT WIDESPREAD CIRRHOSIS PLATELET (Limits for compassionate use: ) DIABETIC IMMUNOSOPPRESSIVE TREATMENT MAINTENANCE THERAPY INF PEG + RIBA

65 INF PEG alfa + RBV Copie/mL February 2011

66 Lead in: 18 weeks INF PEG alfa + RBV boceprevir Copie/mL February 11May 11

67 INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIRWeek 2 4 log decrease boceprevir boceprevir Copie/mL February 11 May 11

68 INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIRWeek 4 5 log decrease boceprevir boceprevir Copie/mL February 11 May 11

69 INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIRWeek 6 HCV RNA negative boceprevir boceprevir Copie/mL February 11 May 11

70 HCV RNA negative INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIR – 48 WEEKS May 12

71 LAST HCV RNA (FEBRUARY 2013)SVR 36 !

72 WAS IT EASY? NO 2 SYNCOPES Anemia = Erithropoietina usedSide effects 2 SYNCOPES Anemia = Erithropoietina used Neutropenia =growing factor used Asthenia Disguesya Diarrhea Pruritis

73 186 interferon INJECTIONSWHICH SENSATION? AFTER 186 interferon INJECTIONS 6.714 Ribavirin and other PILLS AND MANY OTHER MEDICATIONS

74 PURCHASED THE RETURN TICKET FROM HELL

75 with compassionate useDAAs EARLY ACCESS with compassionate use may SAVE LIFES And patients are Back to life

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77 In a DISCO with my daughtersBack to life: In a DISCO with my daughters