1 Hepatología 1: Actualización en Hepatitis B: Aportes del Laboratorio7ma. Reunión Científica y 21º Reunión anual de Unidades Centinela para Hepatitis Virales 15 y 16 Octubre 2012 Expandiendo horizontes para un Programa Nacional de Control” “ Hepatología 1: Actualización en Hepatitis B: Aportes del Laboratorio Mg Sara Vladimirsky Servicio Hepatitis y Gastroenteritis Virales INEI Carlos G Malbrán

2 HBV : M. ELECTRÓNICA EN SUEROA: partículas esféricas de 22 nm ( HBsAg), B: Patrícula Viral Completa de 42 nm C: Formas tubulares o filamentosas (HBsAg)

3 Antigeno de superficieEL VIRUS DE LA HEPATITIS B Antigeno de superficie HBsAg DNA Nucleocápside HBcAg

4 Mutantes de la polimerasa (pueden afectan expresión de HBsAg)GENOMA HBV Determinante a Mutantes de la polimerasa (pueden afectan expresión de HBsAg) Mutantes core En el genoma viral reconocemos 4 marcos de lectura abiertos, superpuestos. Ellos son: el gen precore_core, el gen X, el gen de la polimerasa y el gen pres-s. Las mutaciones de mayor relevancia se generan en el gen precore-core, en el gen superficie (mutaciones concapacidad de alterar la detectabilidad del antígeno de superficie, y mutanciones en el gen de la polimerasa, seleccionadas en el contexto de los ttos antivirales, que también tienen la capacidad potencial de aectar la expresión del HBsAg Promotor del precore Stop precore

5 Encapsidación con RNA pregenómicoCICLO REPLICATIVO DEL HBV Sintesis de ccc DNA 3´ 5´ AAA 2.1 kb Transcripción de RNAm 3´ 5´ AAA 2.4 kb Pr. Envoltura 3.5 kb Síntesis de proteínas Encapsidación con RNA pregenómico core pol Del ciclo replicativo destarcar: 1. La sintesis del cccDNA (DNA covalentemente cerrado circular en el nucleo del hepatocito), molécula que no es afectada por ninguno de los ttos disponibles. Luego de ser transcripto este cccDNA en varios RNAm, que podrán seguir distintos caminos: un camino Replicativo, que brindará particulas virales completas, y un camino transcripcional que solo brinda proteínas de envoltura. Envoltura y Secreción Retrontranscripción Reversa DNA Genómico

6 DIAGNÓSTICO DE HEPATITIS BMARCADORES DIRECTOS MARCADORES INDIRECTOS HBsAg HBeAg HBV-DNA antiHBs antiHBc antiHBc-IgM antiHBe

7 HEPATITIS AGUDA B CON RECUPERACIÓN PROGRESIÓN A INFECCIÓN CRÓNICA HBVCURSO SEROLÓGICO Síntomas HBeAg anti-HBe anti-HBc total IgM anti-HBc anti-HBs HBsAg 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100 Semanas después de la exposición Titulo HEPATITIS AGUDA B CON RECUPERACIÓN IgM aHBc anti-HBc Total HBsAg Agudo (6 meses) HBeAg Crónico (años) anti-HBe 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 años Título PROGRESIÓN A INFECCIÓN CRÓNICA HBV 30

8 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011: DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO1. Métodos serológicos Tabla 1: Perfiles serológicos más comunes. HBsAg Anti HBc total Anti HBc IgM Anti HBs Interpretación NEG Sin contacto con HBV POS Hepatitis B aguda; reactivación aguda de infección crónica POS/NEG Infección aguda en resolución; observado en Hepatitis B fulminante Hepatitis B resuelta Hepatitis B crónica Respuesta a vacuna o transferencia pasiva por administración de gamaglobulina

9 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011: DIAGNÓSTICO SEROLÓGICOTabla 2: Otros perfiles serológicos. HBsAg Anti HBc total Anti HBc IgM Anti HBs Interpretación POS NEG Hepatitis B crónica Hepatitis B resuelta, falso positivo, Hepatitis B crónica (En orden de frecuencia) Hepatitis B aguda temprana; antigenemia fugaz post vacunación, tolerancia inmune, mutantes defectivos e inmunosuprimidos. (Evaluar HBeAg y HBV-DNA Cuantitativo)

10 FASES DE LA INFECCIÓN CRÓNICATolerancia Inmune Fase Inmunoactiva Replicación baja/nula Reactivación HBeAg HBeAg-/antiHBe+ HBV-DNA ALT HC leve HC moderada/severa HAI<4 HC moderada/severa cirrosis cirrosis cirrosis HC HBeAg Pos Portador Inactivo HC HBeAg Neg Resolución: HBsAg – antiHBs+ Fattovich (2003) Seminars in Liver Diseases

11 MARCADORES UTILES PARA DISTINGUIR LAS FASES DE LA INFECCIÓN CRÓNICA POR HBVALT HBsAg HBeAg antiHBeAg HBV-DNA (UI/ml) Histología hepática Inmuno-tolerancia Usualmente normal Positivo Negativo >=20.000 Usualmente normal, puede haber inflamación leve Inmuno-clearence Elevadas, pueden ser fluctuantes Inflamación activa. Portador HBsAg inactivo Usualmente normal, puede tener picos <=20000 Grado de anormalidad depende de la severidad de la enfermedad durante la fase de clearence (desde inflamación leve a cirrosis inactiva) HBeAg(-) CHB Picos periódicos >ó<20.000 Inflamación activa Hepatitis B oculta (***) Pueden ser elevadas Positivo/Negativo <20.000 Desde normal a cirrosis y hepatocarcinoma *** No es reconocida como una fase de la Hepatitis B crónica Valsamakis. Molecular Testing in the Diagnosis and Management of Chronic Hepatitis B. CMR Julio 2007, p. 426–439 .

12 PERFIL DE LA HEPATITIS B EN LA INFECCIÓN OCULTA (OBI) Y EN EL “FALSO” OBINivel de HBV-DNA menor de 200 UI/ml Infección con mutantes de escape del Gen S Seropositivo Seronegativo Niveles de DNA comparales con la infección clásica Pérdida del HBsAg después de IA Oculta primaria Pérdida del HBsAg durante la infección crónica Pérdida Progresiva de anticuerpos Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infectionq Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infectionqJournal of Hepatology 49 (2008) 652–657

13 MÉTODOS SEROLÓGICOS DISPONIBLES

14 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011: DIAGNÓSTICO SEROLÓGICOLa relación de positividad (RP) no es una medida cuantitativa aunque indirectamente brinda información al respecto. Indica cómo se comporta la muestra en referencia al nivel de corte (cut-off) del ensayo. Tanto el punto de corte como el rango de RP es inherente a cada ensayo comercial. • RP cercanos al nivel de corte, pueden ser asociados a resultados falsos positivos siendo recomendable en estos casos, repetir los estudios en nueva muestra y/o realizar una técnica alternativa. En todos los casos deben analizarse en el contexto clínico del paciente e incluir el resto de los marcadores serológicos y virológicos. • En la elaboración del informe es importante aclarar la técnica empleada, el resultado obtenido, la RP de la muestra y el rango posible de RP. • Las dificultades diagnósticas para la detección de HBsAg en presencia de mutantes de HBsAg dependen del diseño de los ensayos, fundamentalmente del uso de anticuerpos policlonales, monoclonales, o mezclas de ambos

15 HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEPATITIS BPara qué? Detectar y cuantificar genomas virales Secuenciarlos y Genotipificarlos Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el tratamiento) como, a quien, cuando?

16 HBV DNA EN SUERO Marcador confiable de replicación de HBV.Nivel de HBV DNA : depende de la fase de infección : Hepatitis aguda Pico Portación crónica : Inmunotolerancia alto, sostenido Inmuno-eliminación bajo, fluctuante Latencia Clínica muy bajo, no detectable Reactivación alto

17 DETECTAR Y CUANTIFICAR GENOMAS VIRALES: CÓMO?Valsamakis. Molecular Testing in the Diagnosis and Management of Chronic Hepatitis B. CMR Julio 2007, p. 426–439 .

18 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE HEPATITIS BCuantificación del HBV-DNA:Cuando/A quien? Estudio del Estado Replicativo de Portadores Crónicos del HBsAg (HBeAg Pos y HBeAg neg): definir la fase de Infección Crónica Decisión de Tratar Monitoreo del tto Evaluación del Riesgo de evolución a Cirrosis y HCC Investigación Clínica de nuevas drogas.

19 Perfomances similares, con sensibilidades acordes a las necesidades para tomar decisiones clínicas (aunque distinto límite de detección atribuída al volumen de muestra utilizado) Mayores falsos positivos y desvios estándar con extracciones manuales Rangos lineales semejantes (7 log IU/ml), muestras por encima del rango deben ser diluidas con procedimientos validados por el laboratorio Aunque los valores obtenidos con los distintos métodos son similares, las variabilidades intra e interensayo son diferentes, por lo que se sigue recomendando testear al paciente siempre con el mismo método No se estudio dependencia del genotipo

20 MÉTODOS DISPONIBLES Y SUS RANGOS DINÁMICOSGish, Clinics in Liver Diseases 2007:11(4):

21 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011DETECCIÓN DE HBV-NA 3. Detección de HBV-DNA • Marcador más sensible y específico de replicación viral. • Puede hallarse tanto en suero como en tejido hepático, médula ósea y células mononucleares de sangre periférica. • Su detección puede realizarse en forma cualitativa o en forma cuantitativa (carga viral de HBV). • Los métodos cualitativos comerciales tienen aplicación exclusiva en el testeo de ácidos nucleicos en sangre y hemoderivados y no tienen aplicación clínica, salvo en algunos casos ante la sospecha de HBV oculta. • No se recomienda el uso de test cualitativos caseros (in house) en función de no tener un límite de detección estandarizado con unidades internacionales/mililitro (UI/ml).

22 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011DETECCIÓN DE HBV-NA Aspectos importantes a tener en cuenta en carga viral de HBV. • La alta sensibilidad de los ensayos cuantitativos permite su uso en todas las instancias donde es necesario detectar la presencia de HBV-DNA. • La comparación de resultados entre métodos presenta discrepancias, lo que se sugiere utilizar siempre el mismo tipo de ensayo, cuando se aplica al monitoreo intra-tratamiento de un individuo en particular. • Se recomienda que el médico solicitante del estudio, indique la metodología a utilizar y el motivo de su solicitud (cuantificación pre-tratamiento o intra-tratamiento). • No son válidos resultados mayor a límite máximo de detección, debiendo realizarse diluciones hasta arribar al valor correcto. Esas diluciones deben realizarse respetando la matriz de la muestra. • Una carga viral con resultado menor al límite de detección, no implica necesariamente la ausencia de replicación viral. • En el informe debe constar: método, rango activo de cuantificación, valor hallado en UI/ml, copias/ml y logs. No deberían informarse valores inferiores al límite inferior de cuantificación del ensayo. • Aseguramiento de la calidad: para los laboratorios que realizan técnicas moleculares se recomienda establecer un sistema integral de gestión de calidad y la suscripción a un programa de acreditación que garantice la reproducibilidad, sensibilidad y especificidad de los ensayos.

23 EQUIPOS APROBADOS EN LA ARGENTINACONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011 EQUIPOS APROBADOS EN LA ARGENTINA Cobas Taqman HBV Test (Roche) Ampliprep Cobas Taqman HBV Test (Roche ) Abbott Real Time, (Abbott Molecular) Versant HBV bDNA (Siemens)

24 HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEPATITIS BPara qué? Detectar y cuantificar genomas virales Secuenciarlos y Genotipificarlos Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el tratamiento) como, a quien, cuando?

25 Schiff, http://www.medscape.org/viewarticle/510444_2

26 ASOCIACIÓN ENTRE LOS GENOTIPOS DEL HBV Y MARCADORES DE PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD EN PACIENTES CON INFECCIÓN CRÓNICA POR HBV Genotipos comparados B vs C A vs D B C A D Momento de la Seroconverción del HBeAg Más temprano Más tarde Incidencia de seroclearence de HBsAg Mayor Menor Severidad de la histología hepática Incidencia de progreción a cirrosis y HCC Kao JH . Molecular epidemiology of HBV. korean j intern med 2011;26:

27 DETERMINACIÓN DE GENOTIPOS / ESTUDIO DE VARIANTES Y MUTANTES: CÓMO?H.M. diferencial luego de PCR RFLP LiPA Secuenciación (gold estándar) Etc etc (más de 10 métodos) (Guirgis, 2010)

28 GENOTIPOS DEL HBV: Cuando y a quien?Importantes sociedades científicas…. han recomendado más estudios para establecer la correlación entre los genotipos de HBV y la evolución clínica antes de recomendar el uso del genotipo en el manejo de la hepatitis Guirgis, 2010; IJIF 14 (2010) e941–e953

29 CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011GENOTIPIFICACIÓN GENOTIPIFICACIÓN • El genotipo del HBV ha sido reconocido como un factor predictivo de respuesta al tratamiento con interferón. El genotipo A tiene buena respuesta, mientras que la respuesta del genotipo D es pobre. • El genotipo es una herramienta útil, sin embargo en la decisión terapéutica individual el genotipo no debería por sí mismo definir la decisión de tratamiento. • En nuestro medio debe evaluarse su valor como predictor de respuesta, especialmente en el genotipo F, predominante en la región.

30 HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEPATITIS BPara qué? Detectar y cuantificar genomas virales Secuenciarlos y Genotipificarlos Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el tratamiento) como, a quien, cuando?

31 IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES PRECOREHabitualmente, se realiza a través de la combinación de los parámetros virológicos, bioquímicos e histológicos. HBsAg Positivo HBeAg (-) / anti-HBe (+) HBV DNA a títulos altos Evidencia de daño hepático: ( ALT generalmente elevada, o evidencia histológica de inflamación) Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439

32 Test para estudio de Resistencia antiviralReaparición en suero del HBV DNA después de un periodo de indetectabilidad o elevación mayor a 1 log por encima del nadir en un paciente con rspuesta terapéutica documentada . La resistencia se puede demostrar por estudios: Fenotipicos Secuenciación LIPA En la práctica se la considera por el aumento en la carga viral en el paciente con respuesta documentada al tto. Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439

33 TESTS PARA ESTUDIAR RESISTENCIA A DROGAS Y GENOTIPOS DE HEPATITIS B

34 DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ANTIVIRALESCONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011 DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ANTIVIRALES 4. Detección de resistencia a antivirales La resistencia a antivirales refleja la susceptibilidad reducida de un virus a los efectos inhibitorios de una droga tras un proceso en el que se pone de manifiesto la presencia de mutaciones de resistencia al iniciarse la terapia. • Mecanismos de Resistencia viral El desarrollo de resistencia se asocia a la presencia de mutaciones que desencadenen cambios en aminoácidos de la polimerasa viral afectando la capacidad de unión de la droga antiviral a la región blanco. • Diagnóstico de Resistencia Existen test para determinar resistencia genotípica y fenotípica. En nuestro medio no hay test disponibles para determinar resistencia fenotípica, sin embargo si los hay para resistencia genotípica (implica determinar las mutaciones asociadas a la generación de resistencia a los antivirales). Se puede realizar mediante: ◊ Secuenciación directa de productos de amplificación del dominio RT de la región de la polimerasa (rt160-rt260). No existen métodos comerciales disponibles y son utilizados métodos in house para realizarlo. ◊ Test de hibridación reversa (Lipa) que consiste en hibridar el HBV-DNA amplificado con sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en tiras de nitrocelulosa. Tienen la desventaja de no detectar todas las mutaciones actuales vinculadas al fallo terapéutico.

35 Suero HBV-DNA HBsAg Viriones Viriones + partículas defectivasINTERPRETACIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN Y DISMINUCIÓN DEL HBV-DNA Y DEL HBSAG EN SUERO Brunetto J Hepatol 2010 Suero HBV-DNA HBsAg Viriones Viriones + partículas defectivas (exceden a los viriones x ) Replicación Replicación Transcripción cccDNA/ Traducción mRNAs HBV-DNA en suero replicación de HBV HBsAg en suero Transcripción cccDNA/ Traducción mRNAs

36 POTENCIALES APLICACIONES DEL MONITOREO DE LOS NIVELES DE HBSAGBeneficios Durante la historia natural Identificación de portadores inactivos Identificar a los pacientes que necesitan terapia ahora o aquellos que es probable reactiven en un futuro cercano No tratar a quien no lo necesita Identificar a los pacientes que necesitan un monitoreo más cercano y posible identificación de los que necesiten tratamiento Durante la Terapia Identificación de pacientes que: es poco probable respondan al PEG-Ifn, Pacientes respondedores rápidos Pacientes que experimentan una rápida declinación de los niveles de HBsAg Reglas de detección de la terapia Motivación Identificar pacientes que tienen alta chance de aclarar el HBsAg y establecer reglas de detección del tto para los que no Liaw. Hepatology, 2011:54(2)

37 ENSAYOS CUANTITATIVOS DE HBSAG (QHBSAG)Existen dos ensayos comerciales disponiples : Architect HBsAg QT (Abbott) y HBsAgII quant (Roche; Elecsys II-Cobas-e). Ambos se encuentran totalmente automatizados. Se trata de EIE en dos pasos sobre microparticulas por quimioluminiscencia. Sus resultados se expresan en UI/ml . HBsAg QT: rango dinámico: 0, UI/ml (Abbott) HBsAgII quant: rango dinámico: UI/ml (sin diluir), rango dinámico: UI/ml (prediluidas). (Roche)

38 ENSAYOS CUANTITATIVOS DE HBsAgCONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011 ENSAYOS CUANTITATIVOS DE HBsAg Son ensayos comerciales (Abbott, Roche) diseñados y controlados para la cuantificación del HBsAg contra un estándar internacional. Su uso no reemplaza al ensayo cualitativo. GENOTIPIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE • Los niveles séricos de HBsAg se asocian con el nivel de ccc-DNA y correlacionan indirectamente con el control de la infección. Por lo tanto se ha investigado su utilidad en la definición de las diferentes fases de la historia natural de la infección HBV y para definir la probablilidad de respuesta al tratamiento a través de su cinética durante el mismo. • En ambas circunstancias debe destacarse que no reemplaza a la determinación del DNA sérico sino que brinda información complementaria. • Los niveles séricos de HBsAg serían útiles en: 1. La diferenciación entre la fase de inmunotolerancia y la de inmunoeleiminación en pacientes con niveles bajos de transaminasas. 2. El diagnóstico diferencial entre el portador crónico inactivo e inmunoescape. • Respecto la utilidad del HbsAg cuantitativo en el monitoreo de la respuesta terapéutica, se ha sugerido que la cinética de declinación del HBsAg sérico en conjunto con la determinación de la carga viral tendría valor predictivo de respuesta especialmente en pacientes tratados con interferón. Su rol debe establecerse en estudios que validen su utilidad. Es necesario definir técnicas de determinación, valores de corte, y las semanas de tratamiento en las que debe ser realizado. • La cuantificación del HBsAg es de gran utilidad, sus indicaciones precisas serán determinadas en un futuro cercano.

39 EL FUTURO? Nuevas aplicaciones para conocidos marcadoresCuantificación del HBeAg Estudio de los intermediarios replicativos del HBV: cccDNA (hígado/suero) Nuevas Tecnologías Next generation sequencing

40 Nguyen, Hepatol Int (2009) 3:S5–S15CUANTIFICACIÓN DE HBEAG (MÉTODOS COMERCIALES AÚN NO DISPONIBLES) Utilidad Potencial: Para estratificar los pacientes entre seroconvertidores espontaneos y pac que requeriran tratamiento Monitoreo de tto con inferferon y con nucleósidos Nguyen, Hepatol Int (2009) 3:S5–S15 La medición cuantitativa del HBeAg durante la terapia podría ser superior al HBsAg y al HBV-DNA como predictor de la seroconversión del HBeAg Tangkijvanich P Hepatol Res. 2010 Apr;40(4):

41 DETECCIÓN DE cccDNA En: Métodos: Utilidad: Tejido hepáticocélulas monocucleares periféricas y de médula, plasma. Métodos: Real Time PCR “Invader” Utilidad: Conocer aspectos de la dinámica de la replicación durante la infección natural y bajo tto Predictor de Respuesta a la terapia antiviral Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439

42 NEXT-GENERATION SEQUENCINGLos nuevos métodos de secuenciación ofrecen nuevas oportunidades pero también crean nuevos desafíos porque generan gran cantidad de datos, y sus resultados pueden ser dificiles de interpretar. Chevalliez, Gastroenterology 2012:142:

43 NEXT-GENERATION SEQUENCINGVentajas: Permite estudiar poblaciones virales minoritarias. La “profundidad” lograda al momento parece ser suficiente para detectar poblaciones virales minoritarias en mezclas de quasispecies complejas. Se puede distinguir si diferentes sustituciones están presentes en el mismo virus o en distintos Desventajas El significado clínico de las poblaciones minoritarias no siempre es claro Puede ser dificil distinguir sustituciones verdades de errores generados por la reacción de secuenciación Desafíos Se necesitan mejorar las herramientas bioinformáticas que contribuirán a transformar la información generada en información util para la toma de decisiones terapéuticas Chevalliez, Gastroenterology 2012:142:

44 Margeridon-Thermet Infect Dis. 2009 May 1; 199(9): 1275–1285.….”UDPS tiene alta sensibiidad para detectar variantes en baja prevalencia, incluyendo mutaciones minoritarias resistentes a drogas, hipermutaciones G-A e infecciones duales en un nivel de sensibilidad no posible hasta ahora” … Margeridon-Thermet Infect Dis May 1; 199(9): 1275–1285. …Monitorear la acumulación de mutantes del HBV resistentes a drogas por UDPS durante la terapia antiviral podria ser utl en el manejo clínico de pacientes con Hepatitis Crónica B. Entender las circunstancias que conducen a la aparición de tales variantes de HBV puede ayudar a guiar futuras terapias … M. Sede et al. / Antiviral Research 94 (2012) 184–187

45 Adaptado de Pawlotzky, Gastroenterology. 2008 134(2): 405–415UTILIDAD DE MARCADORES SEROLÓGICOS Y VIROLÓGICOS EN EL DIAGNOSTICO Y MONITOREO DEL TRATAMIENTO DE LA HEPATITIS B Marcador Clinical trials Practica Investigación ALT en suero Si NO HBeAg/antiHBe HBV-DNA Resistencia genotípica SI SI* Genotipo NO* HBsAg cuantitativo Cuando está disponible Análisis de quasiespecies cccDNA hepático Adaptado de Pawlotzky, Gastroenterology (2): 405–415

46 CONCLUSIONES HBV Es necesario usar las herramientas disponibles criteriosamente, usando aquellas que brindan resultados útiles en el contexto de nuestro trabajo: práctica asistencial, investigación clínica/epidemiológica, investigación básica

47 LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA “Dr. Carlos Gregorio Malbrán”SERVICIO HEPATITIS Y GASTROENTERITIS DEPARTAMENTO VIROLOGIA LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS (INEI) ADMINISTRACION NACIONAL DE LABORATORIOS E INSTITUTOS DE SALUD (ANLIS) “Dr. Carlos Gregorio Malbrán”