1 HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

2 Hibridación de Ácidos NucleicosAplicación Practica : Áreas :Biología Molecular Ingeniería Genética Patología Molecular Esta basada en el proceso de renaturalización de dos cadenas sencillas de ADN previamente desnaturalizado.

3 Estructura secundariaEstabilidad de la doble hélice Estructura primaria Secuencia de nucleótidos Puentes de hidrógeno Apilamiento de bases (stacking) Interacción Estructura secundaria Fuerzas no covalentes Agua Cationes Reversible

4 Pérdida de la estructura secundaria (doble hélice)Desnaturalización Pérdida de la estructura secundaria (doble hélice) Ruptura de fuerzas no covalentes Separación de las dos hebras Replicación Transcripción Fenómeno fisiológico Funcionalidad DNA ARN Apareamientos intracatenarios ARNt, ARNr

5 Agentes desnaturalizantes1. Acidos alteración estructura primaria 2. Bases DNA estable en medio alcalino 3. Agentes químicos Moléculas Polares Pequeñas Grupos amino y carbonilo Urea Formamida Formaldehido 4. Agentes físicos Temperatura

6 Efecto de la Temperatura: Desnaturalización / Renaturalización

7 Desnaturalización: cambios en las propiedades físicas del ADNInfluencia sobre la Viscosidad

8 Desnaturalización: cambios en las propiedades físicas del ADNInfluencia sobre la absorción ultravioleta Bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos , Ac. Nucleicos de cadena sencilla Max. Absorc. (260nm) Sistema de dobles enlaces conjugados Efecto hipercrómico Doble hélice (apilamiento y puentes de H) Efecto hipocrómico

9 Temperatura intermedia de la transición (50% de desnaturalización)Curva de desnaturalización Representación grafica de la variación de la viscosidad o de A260 frente a la Temp. Sigmoidal cambio brusco Fuerzas cooperativas Mecanismo cremallera Temperatura de fusión (Tm) Temperatura intermedia de la transición (50% de desnaturalización)

10 Composición de bases Contenido G+C Mayor estabilidadFactores que influyen en Tm Composición de bases Contenido G+C Mayor estabilidad pH Concentración de formamida Longitud de las cadenas Bases desapareadas % “mismatching” reduce 1º C Fuerza iónica (concentración salina) Efecto de apantallamiento A mayor fuerza iónica del medio, mayor es la Tm

11 Curvas de desnaturalización: significado practicoRelación entre la Tm y el contenido G/C o A/T

12 Curvas de desnaturalización

13 RENATURALIZACION Reversión de las condiciones de desnaturalización1. Lenta: depende del encuentro aleatorio de dos secuencias complementarias Pequeñas zonas de dúplex Velocidad Dependencia de la concentración (Cot) Etapas 2. Rápida: apareamiento del resto de las bases Velocidad Independencia de la concentración

14 Hibridacion de Ac. NucleicosLa renaturalización depende solo de la complementariedad de las secuencias de las hebras. Mezclas de molec.desnat. de ADN DNAs híbridos doble hebra. La formación de Moléculas dúplex de ADN de distinto origen recibe el nombre de hibridación. Si cadenas diferentes de Ac. Nucleicos hibridan entre si, indica que los organismos de donde proceden comparten un cierto grado de herencia evolutiva común. Mayor grado de hibridación, mayor conexión evolutiva entre especies.

15 Ensayo de Hibridación Principio básico : gran especificidad de la interacción entre bases complementarias Elementos básicos: * Secuencia diana * Sonda marcada

16 Ensayo de Hibridación Objetivo básico: Requerimientos UtilidadesIdentificación de una secuencia en una matriz compleja Secuencia diana (target) Cortes con enzimas de restricción Exceso No necesario para ARN Requerimientos Oligonucleótido Secuencia conocida y complementaria al target Sonda (probe) Marcada (isótopos radiactivos, flurocromos, color) Búsqueda de genes relacionados pero no idénticos Utilidades Detectar secuencias en poca cantidad (sensibilidad) Encontrar un gen en un organismo con genoma no secuenciado

17 Rigor de la Hibridación: stringencyGrado de especificidad en el apareamiento conseguido en los híbridos Apareamiento total. Mejora la especificidad Apareamientos incompletos (mismatching) Rigor alto Desventaja: Puede impedir la unión estable sonda-diana Reconocimiento de secuencias homólogas Rigor bajo Desventaja: apareamientos inespecificos e intramoleculares. Falsos positivos

18 Rigor de la Hibridación: stringencyTemperatura Concentración salina Concentración de formamida, urea, etc. Rigor alto Rigor bajo Aumentar temperatura Aumentar concentración formamida Disminuir concentración salina Disminuir temperatura Disminuir concentración formamida Aumentar concentración salina

19 Métodos de Ensayos de HibridaciónClasificación: Hibridación en Fase Liquida . Dot-blot y Slot-blot Hibridación en soporte sólido . Hibridación Southern o Southern blot . Hibridación Northern o Northern blot. Hibridación in situ

20 Hibridación en Fase Liquida

21 Hibridación en Fase SólidaEsquema general:

22 Hibridación en Fase Sólida Dot-Blot y Slot- Blot

23 Hibridación en Fase Sólida Southern Blot

24 Hibridación en Fase Sólida Experimento Southern

25 Hibridación in Situ Hibridación in Situ Tisular Cortes de tejidoCélulas intactas Núcleos aislados Hibridación in Situ Cromosómica Hibridación in situ por fluorescencia o FISH

26 Técnicas Relacionadas