1 HIDROLASAS-TRANSFERASASDr. Agustín López-Munguía Facultad de Química. UNAM

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9 Datos de la Confederación Nacional de Productores Agrícolas de Maíz de México (CNPAMM) sobre maíz,El producto agrícola nacional más importante 29 millones de toneladas anuales 8.4 millones de hectáreas, 11 por ciento del PIB agropecuario 3.1 millones de productores 12.5 millones vinculados al cultivo La producción nacional de maíz amarillo: inexistente en los 90’s 200 mil toneladas en el 2000 Actualmente supera 1.2 millones de ton: * agricultura por contrato: industria almidón-fructosa * productores pecuarios * bioetanol

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11 El futuro de la industria del bioetanol dependerá de múltiples “biotecnologías” entre otras:Alto rendimiento de maíz (OGM). Almidón: recuperación y estructura. Diseño y producción de enzimas amilolíticas. Microorganismos modificados para una fermentación eficiente. Recuperación de etanol a través de bioprocesos de alta eficiencia. Fuentes alternas de azúcares fermentables: celulosa y hemicelulosas.

12 CO2 Fotosíntesis Fermentación Gasolina OXIGENO Etanol AlimentosAzúcares Etanol Alimentos Fermentación

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14 Starch granules properties

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18 Evolución divergente que permitió la adaptación de las amilasas a diferentes ambientesPropiedades Globales (especificidad, estabilidad, solubilidad y actividad) a-amilasas Amilasa ancestral CGTasas Maltogénicas Neopullulanasas Millones de años El azar y presiones selectivas

19 Enzimas relacionadas con la degradación de almidónAlmidón crudo Amilosa Amilopectina CGTasa Sistema de transporte específico Glucólisis y vía de utilización de maltosa (generación de energía) a -amilasa (Hidrólisis) (Hidrólisis y Transglicosidación) Cicodextrinasa, Neopullulanasa, Espacio Extracelular Espacio periplásmico Citoplasma Glucoamilasa, a-glucosidasa, b-amilasa y amilasa maltogénica Enzima desramificadora Isoamilasa/amilomaltasa

20 mg CGTasa/l medio de cultivoSilvestre E. coli B. subtilis a-CGTasa (gene de Klebsiella oxytoca) b-CGTasa (gene de Bacillus alcalófilo)

21 Procesamiento industrial del almidónSacarificación Glucosa-isomerasa Almidón crudo gelatinizado Glucoamilasa a-amilasa de B.licheniformis o 60 o C 60 C 0.5 - 3 . 0hr s 36 - 96 h r s C a + + pH 4.2 - 4.5 p H 7 .0 -8 .0 Licuefacción 1 5 o C 5- 8 mi n 9 5 o C 1- 2 h r s p H 6 .0 -6 .5 Isomerización a-amilasa de Aspergillus niger y A. orizae pH 5 . 50 - 62 o C 12 96 h r s Maltodextrinas CGTasa de B. circulans pH 5.5 60 o C 12 - 96 h r s

22 Enzimas amilolíticas y sus diferencias más notables

23 Regiones conservadas entre enzimas que degradan almidónBLI 512 R-I R-II R-III R-IV ALBY TAA Bsta CGTasa 514 482 550 684 MABsta 590

24 Alineamiento múltiple entre enzimas que degradan almidón

25 T AKA-AMYLASE 1 2 3 4 5 6 7 P ANCREA TIC ALPHA-AMYLASE 1 2 3 4 5 Hydr MAJOR MINOR MINOR P ANCREA TIC ALPHA-AMYLASE MAJOR MINOR Hydr olysis of (A) maltopentaose by Aspergillus or yzae a-amylases (Nir ta et al ) and (B) maltotriose and maltotetraose by pancr eatic a-amylase (Robyt and Fr ench 1970)

26 Subsitios -1 +1 -3 +3 +2 -4 -2 + *

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28 Condensation Shift-Binding T ransglycosylation H O 2Possible bimolecular substrate mechanisms for the change in action pattern of por cine pancr eatic alpha-amylase as the concentration of maltotriose incr eases. (Fr om Robyt and Fr ench J. Biol. Chem. 245, 3924, with permission. Copyright 1970 American Society for Biochemistr y and Molecular Biology

29 Mecanismo catalítico de la hidrólisis y transferencia enzimática del enlace glucosídicoDijkstra, B.W. et al., Nature structural biology 6(5):

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31 G – G G – G G G G – G – G G – G – G – G G G – G G – G + G – G

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33 Estructura tridimensional de la a-amilasa mutante de BEstructura tridimensional de la a-amilasa mutante de B. licheniformis en complejo con deca-acarbosa

34 Estructura de la acarbosa y sus principales diferencias con respecto a la maltotetraosa1 2 3 4

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36 Endo amilasa a-amilasa Exo amilasa b-amilasa

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39 Maltosa, maltotriosas y matotetraosasPr ocesamiento industrial del almidón Licuefacción Ca ++ Granulos de almidón Maltodextrinas 105 o C 5-8min 95 C 1-2 hrs BLA pH a-amilasas fungales Maltosa, maltotriosas y matotetraosas (Aspergillus niger) pH 5.5 50-62 o C 12-96 hrs GA 60 o C hrs C 36-96 hrs Glucosa Fructosa Isomerización GI pH Sacarificación pH5.5 60 o C 12-96 hrs Ciclodextrinas CGTasas (B. circulans) T omado de Shaw A. R et al. Curr ent Opinion in Biotechnology (1999)

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42 Mecanismo de reacción de la amiloglucosidasa

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44 Dextrose Saccharification Product: Typical AnalysisComponent Dextrose Maltose Maltotriose Higher saccharides Dry substance Percent, dry basis 2 - 3 1 - 2

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46 Sugar ratios with different enzymes

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50 The simplefied a-carbon backbone structure of Streptomyces olivochromogenes xylose isomerase monomeric subunit. The monomer is composed of two domains, an eight-stranded ab-barrel similar to triose phosphate isomerase and a distinct large loop with little secondary structure. The active site is buried deep inside the ab-barrel domain.

51 ~ Glucose isomerase Keq ~ 1

52 73 % 21 % 6 %

53 Commercial Producers of G1Organism Actinoplanes missousriensis Bacillus coagulans Streptomyces rubiginosus phaeochromogenes Arthobacter sp olivaceous Trade name Maxazyme Sweetzyme Optisweet Spezyme Swetase Manufacturer Gist Brocades and Anheuser-Busch Inc. Novo-Nordisk Miles Kali-Chem Finnsugar Nagase Reynolds Tobacco Miles Laboratories Inc.

54 Producción de glucosa: proceso intermitente. glucoamylase a-amylaseProducción de fructosa: proceso continuo. Glucosa isomerasa Producto: HFCS 52% fructosa, 40% de glucosa y OS..