1 El Factor Inducible por Hipoxia (HIF): Mediador Central en la Respuesta a la Hipoxia

2 HIF-1 Factor de transcripción heterodimérico y ubicuoPerteneciente a la familia PAS de factores de transcripción (ver Kewley et al, 2004) Dos sub-unidades: HIF-1 (826aa) y HIF-1 (774/789aa) Dominios b-HLH-PAS en la porción N-terminal: Dominio basico y porcion C-terminal de PAS  unión al ADN Porcion N-terminal de PAS  heterodimerización

3 La porción C-terminal de HIF-1: dos dominios de activación transcripcional (TADs) amino y carboxi terminal (N-TAD y C-TAD), además de un dominio ODD. TADs: Importantes en la regulación post- traduccional de HIF-1 : hidroxilación, fosforilación, acetilación y/o modificaciones redox TADs: Regulación de la activación génica a través de la unión de coactivadores transcripcionales: a. Interacción con factores de transcripción generales asociados a la RNA pol II b. Actividad histona acetiltrasferasa

4 ODD (O2-dependent Degradation Domain): Involucrado en la regulación de la estabilidad de la sub-unidad  Estabilidad de HIF-1 estrechamente ligada a la disponibilidad de O2 HIF-1 presenta un solo dominio

5 Representación esquemática de la estructura de HIF-1

6 HIF-1: Mecanismo de Acción y RegulaciónNormóxia: HIF- interactúa a través del dominio ODD con un complejo multimérico con actividad ubiquitin ligasa. Complejo ubiquitin ligasa: Proteína supresora tumoral von Hippel Lindau (pVHL): sub-unidad de reconocimiento de sustrato. Dependiente de hidroxilación de Pro-564 y Pro-402 Unión de pVHL (dominio ) a elongin B y C (formación complejo VBC) es facilitada por la chaperonina citosolica CCT: impide autoubiquitinación

7 Complejo pVHL

8 Complejo VBC se une a cullin2 y Rbx1  complejo VBC-CR.Unión de E2 Unión pVHL y HIF-1: Dominio  de pVHL.  sandwich “core” hidrofóbico y residuos polares  formacion de puentes de hidrogeno e interacciones de van der Waals (ver Min et al., 2002) Poliubiquitinación de HIF-1  degradación proteosomal.

9 Ensamblaje del Complejo Ubiquitin Ligasa

10 Hipóxia: HIF- estabilizado. Supresión de la interacción HIF-/pVHLAcumulación citosólica de HIF-. Translocación autónoma y heterodimerización con HIF-1 en el núcleo celular  complejo de unión al ADN HIF-1 (HIF-1/ HIF-1) sitios de consenso de unión HIF-1/ADN (HBS) presentes en los HREs, en la región 5´o 3´ de los genes regulados por la disponibilidad de O2

11 Esquema simplificado de acción de HIF-1

12 Unión de coactivadores transcripcionales generalesRegulación de la actividad transcripcional de HIF: hidroxilación, fosforilación y modificaciones redox en los dominios de activación transcripcional y en dominio N-terminal de unión al ADN. Unión de coactivadores transcripcionales generales histona-acetiltransferasa CBP/p300 SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator 1) TIF2 (Transcription Intermediary factor 2) Mecanismos de retroalimentación negativa de HIF- al nivel de ARNm, proteína y actividad transcripcional P35srj: unión al dominio CH1 de CBP/p300 bloqueando la interacción con HIF “Downregulation” del ARNm con exposiciones prolongadas

13 Algunos factores que afectan la estabilidad y/o la actividad transcripcional de HIFCo2+ (CoCl2) Deferroxiamina (DFO) NO CO H2O2 N-etil-maleimida (NEM) Genistein (inhibidor tirosina quinasa) NaF (inhibidor serina/treonina fosfatasa)

14 Homólogos b-HLH-PAS: distribución y actividadPertenecientes a la familia b-HLH-PAS Características comunes: Homología de secuencia Organización genómica Estabilizados por hipoxia Heterodimerización con ARNT(s) Reconocimiento y unión a secuencia de ADN Transactivación de genes “reporter”

15 HIF-2: Inicialmente denominado “Proteína PAS Endotelial” (EPAS)Expresión complementaria a HIF-1 en diferentes tejidos HIF-3: Variante de “splice” de HIF-3 IPAS (Inhibitory PAS Protein): Carece de C-TAD Efecto inhibitorio en actividad transcripcional

16 ARNT2: Puede formar heterodímeros con HIF-1, HIF-2 y HIF-3 Expresión posiblemente restringida a cerebro y riñón ARNT3 (MOP3): Dimerización débil con HIF- No participa en la respuesta hipóxica

17 Sensores de Oxígeno Cuatro hipótesis: I. Canales IónicosII. Proteínas Hem/NADPH Oxidasas III. Cadena Respiratoria Mitocondrial y ROS IV. Dioxigenasas 2-oxoglutarato/Fe(II) dependientes: prolina y asparagina hidroxilasas

18 I. Canales Iónicos Propuesto como mecanismo de respuesta rápidaIndependiente de inducción de la expresión génica Canales iónicos regulados por O2: Células excitables en los quimioreceptores arteriales y de las vías aéreas (cuerpos carotideos y neuroepiteliales). Liberación de neurotransmisores Músculo liso de la vasculatura pulmonar y sistémica

19 Células neurosecretoras sensibles al O2Ej. Células Tipo I de los cuerpos carotideos (“glomus cells”) Excitación dependiente de la presencia de canales iónicos cuya actividad depende de la PO2 Canales de K+ Hipoxia inhibición de iK+  despolarización apertura canales de Ca+2  cascada de señalización celular Probablemente componente secundario en la cascada

20 II. Proteínas Hem/NADPH OxidasasPrimeros mecanismos moleculares propuestos como sensores de las variaciones de O2 en las células de mamíferos Basada en la afinidad del O2 por grupos prostéticos con átomos de hierro o con núcleos de hierro-azufre Unión reversible al O2  cambios alostéricos que resultan en la adopción de una conformación oxigenada o desoxigenada Dependiendo de la disponibilidad de O2, la conformación adquirida inicia la respuesta transcripcional requerida para mantener la homeostasis de O2

21 Proteínas Hem: Representación esquemática

22 Expresión de Epo inducida por :Hipoxia Co2+, Ni2+ Deferroxiamina Supresión de expresión de Epo y VEGF: CO

23 En contra: CO y DFO pueden actuar a través de una vía distinta CO puede inhibir a HIF No constituye evidencia

24 NADPH Oxidasa Modularía la producción de especies reactivas de O2 (ROS) de acuerdo a la disponibilidad de éste Conversión de O2 a ROS, cataliza la producción del radical O2– • O2– • transformado a H2O2 por acción de superóxido dismutasa.

25 Tasa de producción de H2O2 es directamente proporcional a los incrementos de la PO2 pericelularNormoxia: la expresión de Epo seria baja debido a las altas concentraciones de H2O2 Hipoxia: la producción de H2O2 es menor permitiendo una mayor expresión del gen de Epo

26 H2O2 inhibe la estabilización de HIF-1 En contra: A favor: Incubación de células HepG2 con H2O2 en condiciones hipóxicas suprime la inducción de Epo H2O2 inhibe la estabilización de HIF-1 En contra: Inhibición selectiva de NADPH oxidasa no logra reproducir los efectos de la hipoxia DPI bloquea la inducción del ARNm de Epo así como la unión HIF-1/ADN en células expuestas a hipoxia. Opuesto a lo predicho ya que la inhibición de la producción de O2– • debería imitar los efectos de la hipoxia.

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28 III. Cadena Respiratoria Mitocondrial y ROSCadena respiratoria mitocondrial conforma un centro sensor de O2 y de producción de ROS de acuerdo a la disponibilidad de O2. Hipoxia: cadena respiratoria se inhibe parcialmente, produciendo cambios redox en los transportadores electrónicos que culminan en un incremento de la producción de ROS a nivel del complejo III (Ubiquinona: Citocromo c oxido-reductasa) ROS son liberadas al citosol y actúan como segundos mensajeros oxidantes, ocasionando finalmente la estabilización de HIF- y como consecuencia la activación de la respuesta transcripcional.

29 Células Hep3B: incremento en la producción de ROS incubadas en condiciones hipóxicasIncremento en conjunto con la acumulación de HIF-1 y el aumento en la expresión de Epo, enzimas glicolíticas y VEGF.

30 Células 0: Hep3B carentes de ADN mitocondrial y de una cadena respiratoria funcionalRotenona, Mixotiazol, MPTP (inhibidores) Oxido Nitrico (NO: adición de succinato o antioxidantes Existe aun controversia acerca de la mitocondria como sensor primario de O2 ya que las ROS producidos en el complejo III podrían actuar a un nivel diferente de la cascada de señalización

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32 IV. Prolina y Asparagina HidroxilasasInteracción entre HIF-1 y pVHL depende de la hidroxilación de residuos de prolina en el dominio ODD mediada por una proteína con actividad prolina hidroxilasa Reacción catalizada requiere de oxígeno molecular (O2) además de 2-oxoglutarato como co-sustrato, y Fe2+ como cofactor

33 Asparagina hidroxilasa (FIH-1) : en presencia de O2 el dominio C-TAD es hidroxilado enzimáticamente en un residuo conservado de asparagina (Asn-803) y que esta modificación impide la unión de coactivadores transcripcionales.

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