1 I° Jornadas de cooperación – Escuela de Ingeniería Biomédica de la Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales de la U.N.C. y Área de Ingeniería del Hospital Municipal de Urgencias Aplicación de la Ing. Biomédica en la Medicina actual 10 de Octubre de 2014 Nancy Alicia SALVATIERRA, Dra. en Ciencias Biológicas Profesora Asociada Química Orgánica Biológica, Ingeniería Biomédica, FCEFyN-UNC INGENIERIA EN TEJIDOS – ÓRGANOS ARTIFICIALES

2 En los últimos 20 años, el trasplante ortotópico de órganos se ha convertido en un procedimiento terapéutico irremplazable para pacientes con enfermedades orgánicas particulares, en estado terminal, tales como por ejemplo enfermedades hepáticas, cardiacas, pancreáticas, pulmonares y renales. Principal problema RECHAZO DEL ÓRGANO TRASPLANTADO tasa de mortalidad de 15-25% durante el primer año (trasplante hepático)

3 Las fases en las que el hígado para trasplante sufre daños: 1) Isquemia por calor durante la extracción del órgano del donante 2) Isquemia por frío durante la fase de almacenamiento hipotérmico (4-6°C) (alteraciones celulares tanto en el compartimiento endotelial sinusoidal como en el compartimiento hepatocítico, rápida disminución de los niveles de ATP y ADP tal que las demandas de energía residual exceden la capacidad celular para generar ATP con la consiguiente acumulación de ácido láctico y acidosis intracelular. La degradación de ATP en ADP produce una acumulación de hipoxantina que se asocia con aumentos de calcio intracelular y activación de proteasas 3) Reperfusión del órgano en el receptor ( la degradación de hipoxantina en xantina y posteriormente en ácido úrico con la producción de intermediarios reactivos de oxígeno y daño de tipo oxidativo, lLa actividad disminuida de enzimas como Na/K ATPasas resulta en cambios en las condiciones de equilibrio electrolítico con el consiguiente influjo de agua y dilatación celular)

4 INCUCAI: 7716transplantes en lista de espera, 1071 hepático (4/9/13) (158) insuficiencia hepática aguda enfermedad terminal trastornos metabólicos hereditarios I) Siembra de hepatocitos vena esplénica o porta técnica incapaz de corregir anormalidades o rescatar a un hígado de una insuficiencia hepática. Alternativas al trasplante Los cultivos primarios pierden su morfología y función normal por desdiferenciación o transformación en una transición epitelio- mesenquimal. II) Desarrollo de órganos artificiales: a- Hacer un andamio de colágeno con la forma del órgano que será cubierto por las células del paciente. b- "Tatuar" grupos celulares y formar una estructura montada capa por capa. Así, las venas y las arterias también tendrían que ser creadas. c- Eliminar completamente todas las células del órgano y, a continuación recelularizar con las células del paciente a trasplantar. MATRIZ EXTRACELULAR

5 para facilitar la remodelación constructiva de una variedad de tejidos (piel, submucosa de intestino delgado, vejiga, vasos sanguíneos y y válvulas del corazón) procesa como andamios de dos dimensiones y no requieren anastomosis directa al vasculatura de destino infiltración de las células sembradas dependen de la disponibilidad de oxígeno y la difusión de nutrientes para la supervivencia, mientras que la red vascular de apoyo desarrolla con el tiempo problema más importante andamios preparados desde órganos enteros por técnicas que implican descelularización basado en la perfusión de órganos de donantes

6 MATRIZ EXTRACELULAR “mezcla compleja de moléculas funcionales y estructurales que afectan a una variedad de actividades celulares dispuestas en una estructura única, 3D y específica del tejido” RECIPROCIDAD DINÁMICA la estructura y composición de las moléculas cambian constantemente en respuesta a la actividad metabólica de la población de células residentes, las demandas mecánicas del tejido y las condiciones microambientales gran ventaja Mantenimiento de la composición nativa y la ultraestructura de estos andamios tridimensionales por sobre el uso de materiales sintéticos

7 MATRIZ EXTRACELULAR Su composición, así como sus características macroscópicas y ultraestructurales son sumamente complejas PREPARACIÓN ADECUADA -señales microambientales: la unión celular, la proliferación y la diferenciación celular - apoyo biomecánico apropiado ya que están en un estado constante de flujo varios pasos de procesamiento puede afectar: 1)la estructura y composición del andamio resultante 2)la respuesta del huésped a estos andamios como plantillas para la reconstrucción de órganos. DESCELULARIZACION

8 Fuente : Badylak, Taylor and Uygun. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2011.

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10 RECELULARIZACION Ingeniería de un tejido complejo u órgano requiere la reconstrucción de parénquima, vasculatura, y las estructuras de soporte subyacentes para asegurar la funcionalidad y el éxito clínico Tipo y fuente celularMétodos de recelularización dos pasos principales siembra de células donde la redistribución sea similar a su configuración espacial in vivo cultivo de perfusión para preparar las células para la función in vivo célula ideal: proliferar o autorenovarse dando lugar a los tipos necesarios para formar un órgano o tejido funcional: células autólogas vs alogénicas y células adultas vs embrionarias o progenitoras

11 DESARROLLAR UNA TÉCNICA DE DESCELULARIZACIÓN PROPIA EN HÍGADO DE CONEJOS Y EVALUAR EL RESULTADO DE LA MISMA MEDIANTE ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA Conejos machos neozelandeses de 2.100 ± con el objetivo de realizar una hepatectomía total con preservación de su vasculatura. Técnica de descelularización El hígado se congeló durante 24 h a -80° C y posteriormente se descongeló a temperatura ambiente para ayudar a la lisis celular. En primer lugar, se usó tripsina 0,02 % y EDTA 0,05 % en agua deionizada. En segundo lugar, se usó una combinación de detergentes como Tritón X-100 3 %, SDS 0,1 %, lavados sucesivos con agua deionizada y PBS para arrastrar los restos celulares y los detergentes. Evaluación microscópica Microscopía óptica. se utilizaron dos técnicas de tinción histológica, hematoxilina-eosina (HE) y tinción de plata de Wilde. Microscopía electrónica de Barrido. LASEM, INIQUI-CONICET, UNSa (Microscopio marca JEOL modelo JSM 6480 LV)

12 Curso temporal de los tratamientos

13 Figura 1: Izquierda: Hepatectomía total de conejo. Derecha: Hígado de conejo antes del proceso de descelularizacion

14 Figura 2: Progreso temporal de la descelularización del hígado y según el tipo de agente descelularizante.

15 Figura 3: Lóbulo completamente descelularizado, con la trama vascular conservada

16 Figura 4: Izquierda: Tinción de conductos biliares por punción Vesicular. Derecha: Tinción vascular por inyección de Azul de metileno-agarosa.

17 Figura 5: Comparación histológica de un hígado normal (izq) y una matriz descelularizada (der). Tinción HE. Se observa la presencia de tríada portal en ambos preparados y la ausencia de células y núcleos en la matriz decelularizada (las fotos son representativas de una serie experimentos, n=4).

18 Figura 6: Imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de Capsula de Glisson control (izquierda) y cápsula de hígado descelularizado (derecha). Nótese la integridad de la misma en el hígado descelularizado (las fotos son representativas de una serie experimentos, n=4).

19 Figura 7: Imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de hígado control (izquierda) e hígado descelularizado (derecha) donde se observa el entramado de la MEC sin células (las fotos son representativas de una serie experimentos, n=4).

20 CONCLUSION : - la observación macroscópica del órgano permitió observar una matriz extracelular hepática (MEC) de conejo con una estructura tridimensional preservada y una correcta conservación de los árboles biliar y vascular. - la observación microscópica mostró ausencia de células y de material nuclear así también como la conservación de las fibras de reticulina en la matriz descelularizada. Por lo tanto, el protocolo de descelularización propuesto demostró ser apropiado ya que verificó una ausencia de células y una matriz hepática con conductos vasculobiliares conservados y con una arquitectura tridimensional adecuada para una futura siembra celular.

21 Proyecciones: recelularización verificar la presencia de factores de crecimiento en nuestra MEC. generar estructuras especializadas de soporte para el correcto ensamblaje y función de las células sembradas: células madres de cordón umbilical porcino y hepatocitos de conejo. en un futuro..... Lograr desarrollar ÓRGANOS BIOARTIFICIALES.

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23 Descelularización de corazón de conejo

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