1 Identificación de mutaciones en el gen CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) en pacientes ecuatorianos con fibrosis quística mediante secuenciación de Sanger. Directora de Proyecto: Dra. Patricia Jiménez, M.Sc. Supervisor empresarial : Santiago Aguirre, M.Sc. Elaborado por : Sofía Ortiz Santander

2 CONTENIDO 1.Formulación del problema 2.Justificación 3.Objetivos 4.Marco teórico 5.Hipótesis 6.Materiales y métodos 7.Resultados y discusión 8.Conclusiones 9.Recomendaciones

3 1. Formulación del Problema

4 PROMEDIO DE VIDA Norteamérica y Europa : 38 años Latinoamérica : 20 años Ecuador : 9.5 años Programas de manejo de la enfermedad, diagnóstico oportuno FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Fibrosis Quística GEN CFTR

5 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA +1900 Variaciones en el gen CFTR → difieren de acuerdo al origen geográfico y/o étnico Dificultad en el diagnóstico molecular de la fibrosis quística, América Latina Paz y Miño et. al (1999)  F508 : 27% 46.15% mutaciones ≠ Europa Valle et. al (2007) 1:11.252 recién nacidos F508del, G85E, G542X, G551D, R334W, N1303K. 50% pacientes sin mutación identificada Composición genética diferente entre población española, ecuatoriana y Colombiana Moya et. al (2009) 4/6 pacientes mutación novedosa PRIMER REPORTE EN NUESTRA POBLACIÓN ECUADOR

6 2. Justificación

7 JUSTIFICACIÓN p.F508del, p.G542X, p.R1162X, p.N1303K, p.R334W, p.G85E Luna et. al (2007) Panel de mutaciones seleccionadas geográficamente pacientes con genotipo desconocido

8 JUSTIFICACIÓN Diagnóstico molecular, análisis portador y consejo genético, desarrollo del cribado neonatal y la generación de pruebas rentables. Diversidad de mutaciones del gen CFTR a escala mundial y regional Investigación de este gen en la población ecuatoriana Detectar otras posibles mutaciones prevalentes a nivel regional

9 3. Objetivos

10 Específicos Determinar si la prevalencia de la mutación p.F508del para este estudio es similar a la reportada en otros países de Latinoamérica. Determinar las frecuencias de las mutaciones más comunes: p.G85E, p.G542X, p.G551D, p.R334W, p.N1303K reportadas en la población ecuatoriana. Identificar la presencia de la mutación p.H609R reportada en un solo estudio previo en Ecuador, en los individuos de este estudio y otras mutaciones no reportadas. Definir un panel de mutaciones más frecuentes en la población ecuatoriana. Específicos Determinar si la prevalencia de la mutación p.F508del para este estudio es similar a la reportada en otros países de Latinoamérica. Determinar las frecuencias de las mutaciones más comunes: p.G85E, p.G542X, p.G551D, p.R334W, p.N1303K reportadas en la población ecuatoriana. Identificar la presencia de la mutación p.H609R reportada en un solo estudio previo en Ecuador, en los individuos de este estudio y otras mutaciones no reportadas. Definir un panel de mutaciones más frecuentes en la población ecuatoriana. OBJETIVOS General: Determinar las mutaciones del gen CFTR en pacientes ecuatorianos con fibrosis quística mediante secuenciación de Sanger. General: Determinar las mutaciones del gen CFTR en pacientes ecuatorianos con fibrosis quística mediante secuenciación de Sanger.

11 4. Marco teórico

12 MARCO TEÓRICO GEN Y PROTEÍNA CFTR Brazo largo del cromosoma 7 (q31.2) Familia de los genes ABC 250 kb 27 exones: 6,14, 17 (a y b) mRNA: 6.5kb Brazo largo del cromosoma 7 (q31.2) Familia de los genes ABC 250 kb 27 exones: 6,14, 17 (a y b) mRNA: 6.5kb Gen CFTR Glicoproteína 1480 aa. Membrana de las células que producen secreciones. Glicoproteína 1480 aa. Membrana de las células que producen secreciones. Canal que transporta iones de cloro dentro y fuera de la células, reguladora canales iónicos de Na+ y HCO 3 ⁻ Proteína CFTR

13 FUNCIONES DE LA PROTEÍNA CFTR MARCO TEÓRICO ANORMAL NORMAL Absorción incorrecta de sal. Bloqueo de vías respiratorias Volumen y fluidez reducidos de enzimas exocrinas. Proenzimas Volumen y fluidez reducidos de enzimas exocrinas. Proenzimas Ileo meconial Mala absorción Ileo meconial Mala absorción Infertilidad. EQUILIBRIO DE ELECTROLITOS SECRECIONES CON FLUIDEZ, VOLUMEN Y pH ADECUADOS MUCOSIDAD HIPERVISCOSA DESBALANCE DE ELECTROLITOS MUCOSIDAD HIPERVISCOSA DESBALANCE DE ELECTROLITOS FQ

14 Clase I y II: reducción en la cantidad de proteína CFTR expresada. Clase III y IV: mal funcionamiento del canal CFTR. Clase V: aunque existe producción de CFTR normal, los problemas en la regulación transcripcional hacen que se genere poca cantidad de la proteína Clase VI: degradación temprana de la CFTR en la superficie del canal. ClaseEjemplo I p.Gly542X c.489+1G>T (621+1G>T) c.579+1G>T (711+1G>T) II p.Phe508del p.Ile507del p.Asn1303Lys IIIp.Gly551Asp IV p.Arg117His p.Arg334Trp Vc.1210-12T[5] (alelo 5T) c.3140-26A>G (3272-26A>G) c.3850-2477C>T (3849+10kbC>T) MUTACIONES DEL GEN CFTR Y SU EFECTO EN LA PROTEÍNA MARCO TEÓRICO Latinoamérica: p.F508del, p.G542X, p.R1162X, p.N1303K, p.R334W, p.G85E Ecuador: p.F508del p.G85E p.G542X p.G551D p.R334W p.N1303K. p. H609R

15 DIAGNÓSTICO DE FIBROSIS QUÍSTICA MARCO TEÓRICO 2. Evidencia de anormalidad en el gen CFTR Dos valores de cloruro en el sudor anormales (> 60 mEq / L). Medidas del diferencial transepitelial nasal (NPD) Niveles elevados de la IRT, como método de diagnóstico en recién nacidos 1.Características fenotípicas de la enfermedad Enfermedades crónicas sinopulmonares Alteraciones nutricionales gastrointestinales Síndromes de pérdida de sal Presencia de variantes alélicas patogénicas del gen CFTR

16 DIAGNÓSTICO DE FIBROSIS QUÍSTICA MARCO TEÓRICO Análisis heteroduplex Análisis por enzimas de restricción Hibridación inversa dot Blot Innogenetics (Inno LiPA) ARMS Tepnel (Elucigene) OLA (Cystic Fibrosis Genotyping Assay) Análisis heteroduplex Análisis por enzimas de restricción Hibridación inversa dot Blot Innogenetics (Inno LiPA) ARMS Tepnel (Elucigene) OLA (Cystic Fibrosis Genotyping Assay) Variaciones de secuencia puntuales : De 1 (enzimas de restricción) Hasta 38 mutaciones (Tepnel) Métodos simples y rápidos Sitios de corte no específicos (enzimas de restricción) Patrón de migración no específico para la mutación dada (heteroduplex) Diseño complejo de primers (ARMS) Técnica para detección de mutaciones conocidas

17 DGGE (Electroforesis desnaturalizante en gel de gradiente) DHPLC (Cromatografía liquida desnaturalizante) SSCP (Polimorfismo de cadena simple) Secuenciación (técnica de primera línea o de confirmación después de una prueba de cribado) PCR Multiplex fluorescente (MLPA) DGGE (Electroforesis desnaturalizante en gel de gradiente) DHPLC (Cromatografía liquida desnaturalizante) SSCP (Polimorfismo de cadena simple) Secuenciación (técnica de primera línea o de confirmación después de una prueba de cribado) PCR Multiplex fluorescente (MLPA) Alta sensibilidad > 80% Generalmente se pierde mutaciones homocigóticas. (DHPLC y DGGE) Necesita secuenciación de las regiones ricas en polimorfismos (DHPLC) Sensible a los métodos de extracción. Las duplicaciones pueden ser difíciles de probar (MLPA) Secuenciación: aproximadamente 100% de sensibilidad. Técnica para detección de mutaciones desconocidas DIAGNÓSTICO DE FIBROSIS QUÍSTICA MARCO TEÓRICO

18 SECUENCIACION Y ELECTROFORESIS CAPILAR

19 5. Hipótesis

20 La prevalencia de las mutaciones más comunes reportadas en estudios previos para la población ecuatoriana y en América Latina, es similar a la encontrada en este estudio. Existen mutaciones no reportadas en pacientes ecuatorianos con fibrosis quística. La prevalencia de las mutaciones más comunes reportadas en estudios previos para la población ecuatoriana y en América Latina, es similar a la encontrada en este estudio. Existen mutaciones no reportadas en pacientes ecuatorianos con fibrosis quística. SISTEMA DE HIPÓTESIS

21 6. Materiales y métodos

22 MATERIALES Y MÉTODOS MUESTRAS CLÍNICAS 48 pacientes con diagnóstico o sospecha clínica de fibrosis quística pertenecientes a la Fundación Ecuatoriana de Fibrosis Quística 3 a 5ml de sangre venosa en tubos EDTA. Muestras pediátricas: goteo. Contacto con la Fundación Consentimiento Informado

23 MATERIALES Y MÉTODOS EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO Qiacube de Qiagen NanoQuant Infinite 200 Muestras clínicas sangre total ADN >5 ng/ul y un Radio260/280 : 1.7 − 2.

24 TemperaturaTiempoCiclos 95°C5 min1 95°C30s 40 50°C30s 72°C30s 72°C7 min1 4°C∞ Primers para los 27 exones del gen CFTR diseñados por Montgomery et.al (2007) MATERIALES Y MÉTODOS AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA DE LOS 27 EXONES DEL GEN CFTR Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen Termociclador Gene Amp PCR System 9700 de Applied Byosistems Protocolo de PCR

25 MATERIALES Y MÉTODOS ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA DE PRODUCTOS DE PCR Gel de agarosa al 2%, Buffer TAE 1x Bromuro de etidio (2.5 mg/ul) Blue Juice : Muestra, 1:10. 5ul de TrackIt :100pb Ladder Tamaños de fragmentos coincidentes con Montgomery et.al (2007) Purificación de productos de PCR: precipitación etanol/acetato de sodio de (Francis, 2005) modificado, eliminar dNTPS y primers no incorporados a las cadenas amplificadas

26 MATERIALES Y MÉTODOS SECUENCIACIÓN POR CICLOS TÉRMICOS Termociclador Gene Amp PCR System 9700 de Applied Byosistems Protocolo: 96°C-1 min, (96°C-10s, 50°C - 5s, 60°C- 4 min) por 25 ciclos y 4°C por 5 min. Primers para los 27 exones del gen CFTR diseñados por Montgomery et.al (2007) Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit Purificación de productos de la secuenciación recomendado por el Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, 2002): Precipitación con etanol y EDTA para eliminar los nucleótidos marcados que no han sido incorporados en las cadenas de ADN, con modificaciones

27 MATERIALES Y MÉTODOS ELECTROFORESIS CAPILAR Y ANÁLISIS DE SECUENCIA 3500 Genetic Analyser de Applied Biosystems Análisis de secuencia: SeqScape 3

28 REPORTE DE MUTACIONES

29 7. Resultados y discusión

30 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Extracción de ADN: Todas las muestras de ADN presentaron concentraciones >5 ng/ul y radios 260/280 > 1.7 y 2 PCR 27 exones del gen CFTR: Todos los exones amplificados a partir del ADN genómico de los pacientes, presentaron tamaños de fragmento coincidentes con los propuestos por Montgomery et. al (2007) Para una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng se debe obtener al menos 5 ng/ul de ADN en cada muestra. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteína (Velázquez, Martínez, & Romero, 2007)

31 Paciente Edad Género Ciudad Test del sudor* Diagnóstico molecular 827FQuito 1 Positivo Heterocigoto p.F508del 920MQuito 1 Positivo Heterocigoto p.F508del 159FAmbato 1 Positivo Homocigoto p.H609R 2210FQuito 2 Positivos Heterocigoto p.G85E 242FQuito 1 Positivo Heterocigoto para p.W1098X y p.N1303K 2512MGuayaquil 1 Positivo Homocigoto G85E 324MAmbato 1 Positivo Heterocigoto p.G85E 3821MQuito 1 Positivo Homocigoto p. F508del 4225FIbarra 2 Positivos Heterocigoto p.F508del y p.R1162X 4624MQuito 1 Positivo Heterocigoto p.F508del 481MFrancisco de Orellana 1 Positivo Heterocigoto p.F508del RESULTADOS Y DISCUSIÓN Población de estudio n = 48 11 pacientes con diagnóstico molecular de FQ

32 Gráfico 1. Origen de las muestras clínicas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Población de estudio Gráfico 2. Distribución de las muestras clínicas por grupos etarios Los signos clínicos de la fibrosis quística aparecen en las primeras etapas de vida (Escobar & Sojo, 2002). Es más frecuente diagnosticar la FQ en el transcurso de los primeros meses de vida Hasta la adolescencia o la juventud. En los demás, el diagnóstico se sospecha en la infancia avanzada, a raíz de procesos pulmonares crónicos o diarrea crónica y/o retraso del crecimiento (González et.al,2011) Es más frecuente diagnosticar la FQ en el transcurso de los primeros meses de vida Hasta la adolescencia o la juventud. En los demás, el diagnóstico se sospecha en la infancia avanzada, a raíz de procesos pulmonares crónicos o diarrea crónica y/o retraso del crecimiento (González et.al,2011)

33 Gráfico 4. Distribución de pacientes por resultados del test del sudor RESULTADOS Y DISCUSIÓN Gráfico 3.Distribución de las muestras clínicas por género Población de estudio

34 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis de secuencias 70 variaciones de secuencia en los 27 exones del gen CFTR 5 catalogadas como mutaciones patogénicas: p.F508del, p.G85E, W1098X, R1162X, N1303K. La mutación p.H609R : en 10 pacientes, esta ha sido reportada en un solo estudio en la poblaci ó n ecuatoriana por Moya et.al (2009). Mutaciones que representan alelos benignos : NG_016465.3:g.19304G>C (exón1), NG_016465.3:g.75901C>T (exón 6b) Polimorfismos : p.M470V, p.T854T, p.T966T, p.P1290P, p.Q1463Q, p.Y1424Y. Mutaciones sin significado clínico asignado Variaciones de secuencia fuera de la región del exón: NG_016465.3:g.19395G>A (exón 1), y c.204099A>C (exón 22) Dequeker et. al (2009) la secuenciación del gen CFTR tiene mayor sensibilidad con respecto a otras técnicas moleculares como la Hibridación, SSCP, DDGE utilizadas para la detección de mutaciones. Valle et. al (2007) : prevalencia de mutaciones en población ecuatoriana con fibrosis quística : kit comercial de 29 mutaciones (técnica de hibridación) del gen CFTR. 50% de los pacientes quedaron sin mutación identificada.

35 Frecuencias alélicas de las mutaciones del gen CFTR RESULTADOS Y DISCUSIÓN

36 Selección de pacientes para cálculo de frecuencias alélicas 1 o más características fenotípicas propias de la enfermedad Evidencia de la anormalidad en la función del gen CFTR por: Variantes alélicas patogénicas del gen CFTR, 2 valores de cloruro en el sudor (> 60 mEq / L), Medidas del diferencial transepitelial nasal (NPD), Niveles elevados de la IRT Diagnóstico de la fibrosis quística (Moskowitz, y otros, 2008): 25 pacientes con variantes patogénicas 7 pacientes con diagnóstico clínico confirmado (doble positivo para el test del sudor) con mutaciones sin significado clínico asignado

37 Tabla Alelos para las mutaciones patogénicas de este estudio MutaciónNúmero de Pacientes Número de alelos Frecuencia alélica relativa (%) p.F508del 1315 23.44 p. H609R 10 14 21.88 p. G85E 5 6 9.38 p.W1098X 2 2 3.13 p.R1162X 1 1 1.56 p.N1303K 1 1 1.56 Alelos con mutaciones patogénicas 25 (78%) 39 60.95 WT o normales para las mutaciones patogénicas 7(22%)25 b 39.05 Total32n= 64 100% RESULTADOS Y DISCUSIÓN Frecuencias alélicas de mutaciones patogénicas encontradas en este estudio. Valle et. al (2007): 50% de los pacientes quedaron sin mutación identificada.

38 Tabla 15. Prueba de hipótesis para la diferencia de proporciones de las mutaciones RESULTADOS Y DISCUSIÓN p.F508del es la más común en pacientes con fibrosis quística a nivel mundial con una frecuencia del 66% (Collazo, 2008). p.G85E tiene una prevalencia a nivel mundial del 0.2%, + frecuente en la región del Mediterráneo: España 1%, e Italia con el 1,7% (Decaestecker, Decaestecker, Castellani, Jaspersz, Cuppensz, & Boeck, 2004). Valle et. al (2007) la prevalencia de la mutación p.G85E en Ecuador es mayor a nivel latinoamericano, incluso a nivel mundial siendo mayor que la descrita en el sur de Grecia de donde se cree se originó. La mutación p.W1098X no ha sido reportada en otros países de Latinoamérica ni en España, pero si en países como Turquía con una frecuencia 0.6% (Bobadilla, Macek, Fine, & Farrell, 2002) e Israel 1% (World Health Organization, 2006)

39 Luna, Pivettaa, Keyeuxb, & Perez, CFTR gene analysis in Latin American CF patients: Heterogeneous origin and distribution of mutations across the continent (2007) Ilustración 21. Árbol de distancias de países de Latinoamérica de acuerdo a las mutaciones patogénicas del gen CFTR.

40 Tabla 15. Prueba de hipótesis para la diferencia de proporciones de las mutaciones RESULTADOS Y DISCUSIÓN Moya et. al (2009) : 4/6 pacientes ecuatorianos con fibrosis quística con doble positivo para el test de cloruro del sudor y con cuadro fenotípico de la enfermedad: insuficiencia pancreática, colonización con Pseudomonas aeruginosa, deterioro en la función pulmonar de acuerdo a valores de FEV1 entre el 36 y 75%.

41 Paciente n°Edad Test de sudor I Test de sudor II Signos clínicos Criterios de sospecha clínica diagnóstica de la OMS de acuerdo al grupo etario* 159119 Problemas permanentes de sinusitis crónica y ha tenido colonizaciones por Pseudomonas aeruginosa Escolares:  Síntomas respiratorios crónicos inexplicados  Pseudomonas aeruginosa en secreción bronquial  Sinusitis crónica  Bronquiectasias 3011Problemas pulmonares 4525115131 Problemas pulmonares leves, y problemas pancreáticos. Paciente hospitalizado por pancreatitis. Adolescentes y Adultos:  Enfermedad pulmonar supurativa crónica e inexplicada  Dolor abdominal recurrente  Pancreatitis  Síndrome de obstrucción intestinal distal  Cirrosis hepática e hipertensión portal 1628134Bronquiectasias, paciente hospitalizado frecuentemente por exacerbaciones pulmonares y digestivas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 12.Datos clínicos de pacientes homocigotos para la p.H609R

42 56 Variaciones sin reporte de patogenicidad + Calidad del diagnóstico clínico previo 16 pacientes (33% de la población de estudio) Sin diagnóstico clínico y/o molecular confirmado de fibrosis quística Lay et. al (2014) Secuenciación región codificante y segmentos intrónicos adyacentes a los exones : 90% de detección en el total de alelos. Gran proporción de variantes no identificadas Certeza del diagnóstico clínico de fibrosis quística sometidos a estudio molecular. Secuenciación región codificante y segmentos intrónicos adyacentes a los exones : 90% de detección en el total de alelos. Gran proporción de variantes no identificadas Certeza del diagnóstico clínico de fibrosis quística sometidos a estudio molecular. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

43 Regiones intrónicas o reguladoras del gen CFTR. Intrón 16 (Bienvenu, Cartault, Lesure, Renouil, Beldjord, & Kaplan, 1996) Intrón 23 (Yoshimura, Chu, & Crystal, 1992), Variaciones de secuencia fuera de la región del exón: NG_016465.3:g.19395G>A (exón 1), y c.204099A>C (exón 22) RESULTADOS Y DISCUSIÓN

44 8. Conclusiones

45 CONCLUSIONES La secuenciación de los 27 exones del gen CFTR mediante el método de Sanger permitió la identificación de 70 variaciones de secuencia en el gen CFTR dentro de estas las mutaciones patogénicas p.F508del, p. H609R, p.G85E, p.W1098X, p.R1162X y p.N1303K corresponden aproximadamente al 78% de los pacientes con diagnóstico de fibrosis quística de este estudio. Las mutaciones más frecuentes: p.F508del, p.G85E, p.W1098X, p.R1162X y p.N1303K identificadas en esta investigación han sido reportadas en estudios previos, sin embargo presentan frecuencias alélicas relativas propias para la población ecuatoriana.

46 CONCLUSIONES La mutación p.H609R es la segunda más frecuente en la población estudiada y constituye el segundo reporte en pacientes ecuatorianos con Fibrosis Quística, siendo probablemente una mutación causante de la enfermedad de acuerdo a la clínica de los pacientes que la presentan. Las mutaciones p.F508del, p.H609R, p.G85E, p.W1098X, p.R1162X y p.N1303K, deberían incluirse en el screening diagnóstico de la enfermedad en nuestro país.

47 Se debería evaluar la prevalencia de las mutaciones p.G542X, p.G551D, y p.R334W encontradas en Ecuador por Valle et. al 2007 en la población ecuatoriana para incluirlas o no en el panel de las mutaciones más comunes para el screening inicial de fibrosis quística, ya que este estudio no las detectó. CONCLUSIONES

48 9. Recomendaciones

49 RECOMENDACIONES Realizar un análisis de las variantes NG_016465.3:g.19395G>A y c.204099A>C en próximos estudios para entender el efecto que puedan tener estas variantes en la proteína ya que al encontrarse fuera de los exones 1 y 22 respectivamente, posiblemente se ubican en regiones intrónicas o reguladoras del gen CFTR. Definir el significado clínico de las variaciones de secuencia no reportadas previamente encontradas en este estudio, realizando ensayos tanto en pacientes con fibrosis quística como en individuos normales, junto una recolección más profunda de los datos clínicos de los pacientes.

50 Para completar el análisis molecular en pacientes con diagnóstico clínico de fibrosis quística que después de la secuenciación sigan manteniendo un genotipo desconocido se debería buscar variaciones en las regiones intrónicas y de unión intrón-exón, además de grandes deleciones y duplicaciones (MLPA) en el gen CFTR. RECOMENDACIONES

51 Gracias!!!