1 Identificación y análisis de genes estadío específicos en Trypanosoma cruzi Fernán Agüero 1, Valeria Tekiel 1, Karim Ben Abdellah 2, Antonio González 2 y Daniel O. Sánchez 1 1 Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, Universidad Nacional de General San Martín, San Martín, Argentina 2 Instituto de Parasitología y Biomedicina, Granada, España {fernan,valet,dsanchez}@iib.unsam.edu.ar [email protected]
2 Genomics :: historia En 1994 la OMS decidió impulsar la secuenciación de genomas de parásitos importantes desde el punto de vista sanitario. Uno de los primeros objetivos, aun antes de comenzar a secuenciar el genoma, fue el descubrimiento de genes. Distintos proyectos fueron comenzados a ese fin y varias redes de laboratorios se organizaron para llevar a cabo el proyecto. En Trypanosomas: secuenciación de ESTs secuenciación de GSSs mapeo
3 Expressed sequence tags (ESTs) Qué es un EST? Es una secuencia proveniente de un transcripto (mRNA) obtenida al azar. Es una secuencia corta, no editada ni corregida, obtenida mediante una única reacción de secuenciación. Cómo se produce un EST? A partir de una biblioteca de cDNA, por secuenciación de extremos de clones seleccionados al azar.
4 Biblioteca de cDNA Biblioteca de cDNA. Distintos clones obtenidos a partir del mismo transcripto pueden diferir en el extremo 5' Si la biblioteca está orientada, se puede elegir el extremo del clon a secuenciar. Se pueden producir ESTs 5' o 3' AAAAAAAA Copias de parciales del mRNA cDNA clonado 5' EST 3' EST Fwd sequencing primer Rev sequencing primer
5 ESTs :: calidad de secuencia VectorRepeat Un EST contiene información de secuencia de calidad variable, con contaminantes
6 Información presente en un EST Qué información provee un EST? En primer lugar: Secuencia de un producto de expresión (gen) En forma adicional: información de expresión: sitio de expresión (estadio del ciclo de vida / órgano / tejido) condiciones de expresión (condiciones experimentales)
7 Redundancia La secuenciación de ESTs genera redundancia Una única library de cDNA: La redundancia proviene de la selección al azar de los clones a secuenciar (estadística, se puede estimar) Distintas libraries de cDNA de distintos estadios/tejidos: Redundancia adicional (varios ESTs correspondientes a un mismo transcripto que se expresa en distintos estadios/tejidos) Dos tipos de redundancia: secuencia información de expresión
8 Manejo de la redundancia in vitro construcción de libraries normalizadas o sustractivas in silico agrupar ESTs en 'clusters' (por similitud) generar un set de datos no-redundante en el cual cada 'cluster' es representado por una única secuencia
9 ESTs en T. cruzi cDNA libraries epimastigotes, no normalizada, 252 ESTs epimastigotes, normalizada, 9630 ESTs trypomastigotes metacíclicos (differential display), 175 ESTs trypomastigotes, no normalizada, 1507 ESTs [*] trypomastigotes, sustractiva (- epimastigotes), 403 ESTs [*] amastigotes, no normalizada, 1328 ESTs [*] Laboratorios Instituto Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil. Department of Genetics and Pathology, Uppsala Universitet, Sweden. Instituto de Biologia Molecular do Parana, Parana, Brasil Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM, Argentina. Instituto de Parasitología y Biomedicina, CSIC, España.
10 T. cruzi ESTs :: gene discovery Comparación de las secuencias (ESTs) contra bases de datos de proteínas e identificación de similitud/homología para intentar predecir función Uppsala Universitet: Genome Research 10 (2000): 1103-1107 IIB-UNSAM: Infection & Immunity 66 (1998): 5393-5390 Inst. Fiocruz, Brasil & Inst Parsitología, España: Mem Inst Oswaldo Cruz 92 (1998): 863-866 Estudio de un proceso (metaciclogenésis) mediante differential display: Inst Biologia Molecular, Parana, Brasil: Mem Inst Oswaldo Cruz. 94 (1999) Suppl 1:165-8
11 ESTs de trypomastigotes y amastigotes Proyecto TRAM http://genoma.unsam.edu.ar/projects/tram Dos bibliotecas de cDNA TcTR (trypomastigotes) TcAM (amastigotes) Proyecto TcT-E Una biblioteca sustractiva de cDNA Trypomastigotes - Epimastigotes
12 TRAM: Construcción de las bibliotecas Síntesis de la primera hebra de cDNA a partir de oligo-dT Síntesis de la segunda hebra de cDNA a partir del miniexón Análisis de las primeras 23-25 bases de todos los ESTs: Usando fuzznuc (European Molecular Biology Open Software Suite, EMBOSS) Permitiendo 2 errores de secuencia 1551 clones (55.4%) tienen extremos 5' completos
13 Reconstrucción de transcriptos Raw ESTs Clusters Alignments Consensi Joined Consensi predict CDS Protein Fragments NNN 2771 ESTs totales fueron agrupados en un set no- redundante de 1619 secuencias 437 consensos 1182 singletons
14 Analisis de similitud de secuencia contra bases de datos públicas BLASTX: GenBank, Swissprot, KOG (genomas eucarióticos completos) BLASTN: dbEST, Borrador del genoma de T. cruzi
15 TRAM: comparación con otros sets de ESTs Usando BLASTN Alineamientos significativos son aquellos con un E ≤ 1 -40 505 ESTs (31.1%) fueron significativamente similares a otros ESTs ya disponibles en bases de datos públicas 1116 ESTs (68.8%) representan nuevos ESTs
16 Información accesible en sitio web Una página web mostrando un grupo de ESTs que comparten un patrón de aciertos (matches) contra distintas bases de datos. http://genoma.unsam.edu.ar/projects/tram
17 Información accesible en sitio web Testcode evaluationPresencia de miniexon
18 Composición de los clusters Hay clusters enriquecidos en ESTs de una de las dos biblitecas en particular? Análisis estadístico: Stekel DJ, Git Y, Falciani F. The comparison of gene expression from multiple cDNA libraries. Genome Res (2000) 10:2055. Calcula un valor R (log likelihood) que está relacionado con la verosimilitud de la hipótesis de que la diferencia en la composición se debe a una diferencia de expresión y no a un desvío en el muestreo
19 Composición de los clusters Ribosomal proteins with extraribosomal functions (Wool IG, TiBS 1996 21: 164) S12 is a RNA chaperone. Enhances phage T4 intron splicing in vitro. SA is also located at the cell surface. Functions as a high-affinity laminin receptor
20 Construcción de la biblioteca substractiva cDNA trip cDNA epis Tripos RNA Total mRNA 1 era hebra cDNA doble cadena Digestión RsaI Epis
21 Control final construcción library TcT-E 18 23 28 33 18 23 28 33 - H2A Subs T-ESin subst Análisis de eficiencia de substracción
22 47 (11.6%) 14 (3.4%) 102 (25.3%) 31 4 17 ESTs T. cruzi trypomastigotes ESTs T. cruzi epimastigotes Protein Databases TcT-E: Distribución de los ESTs
23 Reverse Northern Trypomastigote cDNA Epimastigote cDNA Northern reverso 86 clones testeados en 2 ensayos similares independientes
24 TcT-E: confirmación de expresión diferencial de clones seleccionados Northern blots Control: gp63 (T.cruzi) E T 02g6 E+K+TcTr 02j12 E T Pre-RNA proc (L. major) 01i24 Todo neg 01b11 Bop (SP/NR) E T 01a18 Rib E T E+K, no codif 01p24 E T Todo neg
25 Reconocimientos Laboratorio de Genómica y Bioinformática, IIB-UNSAM Daniel O. Sánchez Secuenciación de ESTs Valeria Tekiel Ramiro Verdún Nelson Di Paolo Fernanda Peri Rodrigo Pavón Diego Rey Serantes Bioinformática Fernán Agüero Colaboradores Antonio Gonzalez, Instituto de Parasitologia y Biomedicina, CSIC, Espa?a Carlos Frasch, Instituto de Investigaciones Biotecnologicas, UNSAM, Argentina.
26 Uses of EST data Gene discovery still important for species with no genome sequence Detect transcript variation Alternative trans-splicing? Cis-splicing? Map untranslated regions (UTRs) ESTs provide experimental evidence for trans-splicing and polyadenylation sites UTRs derived from EST data can then be used as a training dataset for gene finding algorithms
27 Leishmania major (2,184) Promastigote (1,295) Other (LV39, Friedlin, 889) Trypanosoma carassii (1,921) Phytomonas sp. (2,206) Available EST data for Trypanosomatids Trypanosoma cruzi (14,240) Epimastigotes: 9,922 Trypomastigotes: 1,906 Amastigotes: 2,237 Differentiation (metacyclogenesis): 175 Trypanosoma brucei (5,134) Bloodstream form: 4,285 Procyclic: 536 Differentiation: 223 Total 25,685
28 Our goals Provide an integrated resource for trypanosomatid EST data Provide annotated reconstructed transcripts Important for trypanosomatids with no genome sequence Exploit the available EST sequence data to map untranslated regions of genes See if this can be used as experimental evidence to refine gene predictions Integrate the available expression data Extract this info from dbEST/UniLib (cDNA library construction info) Subtractive libraries Differential expression libraries
29 Curation of data Datasets obtained from dbEST show great variation in the amount and quality of the information provided for each EST: clone from which the EST was sequenced sequencing primer Quality trimming info (high-quality start/stop) Presence/trimming of polyA For the whole dataset Strain, cell type / developmental stage cDNA Library construction information We have used UniLib (NCBI, now discontinued) to obtain EST datasets 27 datasets, each derived from a separate cDNA library Example problem: T. cruzi normalized epimastigote EST library (single library, divided into separate clone sets for sequencing), appeared in UniLib as 4 different cDNA libraries
30 Transcript reconstruction Clustering using stackPACK (Electric Genetics) 1. Alignment-independent clustering step (loose) d2_cluster 2. Alignment-dependent contig creation within each cluster Phrap 3. Generation of additional consensi for contigs showing variation CRAW 3. Or realign contigs using partial order graph based algorithms can generate several paths on the graph, each corresponding to a different sub-alignment POA & POAVIZ (Christopher Lee, UCLA)
31 Example analysis using T. cruzi data Transcript reconstruction Assemble EST clusters against T. cruzi CDS sequences 25,041 CDS 14,240 ESTs 3,548 clusters, 3,790 contigs, 4,103 consensus Parse multiple sequence alignments (contigs) to look for ESTs anchored on the 5' or 3' ends
32 UTR reconstruction Color Key: Miniexon UTR CDS CDS members: cds.1, cds.12801, cds.18381, cds.245 EST member: est.1201 Automatically generated colored visualization from the data In this example: Contig 1 Hypothetical protein Full length transcript reconstructed Both 5' (miniexon) and 3' (polyA) UTRs are complete ESTs from an amastigote cDNA library
33 Alignment of reconstructed transcript against the genomic sequence 1 50 ct1 GTGATACAGTTTCTGTACTATATTGCACGAAAAGAACAAAAAAAGAGGG. cds.1 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~GAAGCACGAAAAGAACAAAAAAAGAGGGG 51 100 ct1...GGGGCGGGAGTGAGTGAGTGCCTTTTGTGTAATGACTCCTCCGTCTC cds.1 GGAGGGGCGGGAGTGAGTGAGTGTCTTTTGTGTAATGGCTCCTCCGTCTC............................................ 551 600 ct1 TTTTGGCCCTCCACACAGTTTCCTGATAATCAACGTTTATTTGCGGTAGT cds.1 TTTTGGCCCTTCACACAGTTTCCTGATAATCAGCGTTTATTTGCGGTAGT 601 650 ct1 CCTCTAGTGCCTCTTCTTTTTAAAAAA~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ cds.1 CCTCTAGTGCCTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGCCATTTATT 651 700 ct1 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ cds.1 TATTTATTTATTTGTTTAGTGATGTTTCTTATTTTTCTTTTTCTTTTTTA miniexon 5' UTR PolyA tail 3' UTR
34 Some numbers for the T. cruzi dataset We identified 5' UTRs in 1,152 contigs (30.4%) 255 of these (22.1%) have a minexon sequence Some contigs showed the miniexon attached adjacent (1bp) to the predicted translation start codon (ATG) Revise CDS prediction? We identified 3' UTRs in 1,614 contigs (42.5%) 68 of these (4.2%) have putative polyA tails There were 402 contigs (10.6%) with both UTRs.
35 Transcript variation CRAW analysis (stackPACK) 261 contigs showed variation Splitted into 374 consensi Average 2 consensus sequences per contig An example from the T. cruzi dataset Contig 1212 (low similarity to ribosomal protein L22) 3 highly identical CDS sequences Different UTRs reconstructed from EST data
36 A transcript variation example ATGGTGGCGGTTCGTGCAAAGGTCGGTTCCCGCGGCTTCGTCCGCCAGAAGCAACTGGCG cds.2064 *********************************** ** ************** ****** Cds.2064 CAGAGGGAAGGACACCTACCAGCTGAAGT *** ************************* ACTTCAACATCCAGGATCAGGAGGAGGCGTAG ******************************** G-CAT---CCAAAGGCTCATTAGCAACGGGTCCA-ATGTTG-GTATGGTCTTACGT- CAC GACGTGTGACACGG---TGGTGTGGATGGGG-GAGA-GTAGCGCTTTGTC- CCCGTACAC * * * ** * * * *** * * * * * * *** *** *** CTTT- TGCGTCCCTGTTTTGTCTCTATTCTTCACCTGCGGAGAGAGAAATCAGGGAAATG CTTTCTGC--------------------------------------------------GG **** *** * ATGTCATTCTTTCCCTCTTATTGTCTATC-TTCTTAGTCCC- GCTCTGAACTTTTTAGTT ATGTC- TTCTTTCTTTCTTTTTTCCTTTGGTTGTTCGTCTCTGCTCGGCCTTTTTTATTT *** * ** **** *** ** * * * ** *** * * * * ***** ** GTTAGTTCAATTATATCTGCGTATCTCTTGCAAGATGTGAGTGGAACT----- UTR 1 ATTTATTTATTTATTTATTTCCATGGCGGAAAAAAAATACAAAAAATAACAAC UTR 2 ** ** * **** * * * * ** * ** UTR 1 GTGATACAGTTTCTGTACTATATTTGAGGGGGAAAAACGAGGAAGAAAAGGAGGCTTTAG UTR 2GTGATACAGTTTCTGTACTATATTGGTGGAGCAGGAGCAA----- AGAGTGAGGCGAAGG ************************ * ** * * * * * * * ***** * UTR 1GAAGAAATTTGTTTCGTTTTTTTTTCTTCTTTTTTTTCTGTT- TCACAATACCAGAAGAA UTR 2TCAAA-----------TCATTCACGC-ACACGCACACAGAACATCTCTACAAGACACG- C * * * ** * * ** * * * * * * UTR 1AAG-AGAAC UTR 2GTGTA-AAT * * ** Color Key: Miniexon UTR CDS Variation Contig 1212 ~ 30% identical to ribosomal protein L22 3 CDS members, 21 EST members
37 Design and development of an integrated resource MySQL Database Schema follows GUS loosely Modifications needed to accommodate stackPACK clustering strategy (Cluster→Contigs→Consensi) Custom Perl code Using BioPerl and some local modules Web interface Provide unified access to annotated, analyzed and integrated EST data Being developed...
38 Thanks! Trypanosoma cruzi ESTs Lena Aslund, Bjorn Andersson, Sweden Alberto Delgado, Karim Ben Abdellah and Antonio Gonzalez, Granada, Spain Santuza Teixeira, Belo Horizonte, Brazil Wim Degrave, Rio de Janeiro, Brazil CS Baptista, Bianca Zingales, Sao Paulo, Brazil Vanessa Sotomaior, S Goldenberg, MA Krieger, Parana, Brazil Valeria Tekiel, Ramiro Verdún, Nelson Di Paolo, Alberto Carlos Frasch, Daniel Sanchez, Buenos Aires, Argentina Trypanosoma brucei ESTs Elisabetta Ullu, Christian Tschudi, New Haven, USA Mathieu-Daude F, M McClelland, San Diego, USA Shaki SK, Christine Clayton, Heidelberg, Germany. Phelix Majiwa, John Donelson, Kenya/USA A Osanya, R Pelle, NB Murphy, Kenya Phytomonas sp ESTs Antonio Gonzalez, Granada, Spain Leishmania major ESTs Renata Almeida, MP Levick, JW Ajioka, Jenefer Blackwell, Cambridge, UK Gueiros-Filho F, Berverley S Trypanosoma carassii ESTs Vanina Campo, Peter Overath, Alberto Carlos Frasch, Daniel Sánchez, Buenos Aires, Argentina BioPerl and the bioperl-l mailing list Jason Stajich, Lincoln Stein, Josh Burdick StackPACK (Electric Genetics) Johann Visagie, Liza Groenewald, Irvine Short, Tzu-Ming Chern, South Africa. POA and POAVIZ Michael Quist and Catherine Grasso (Christopher Lee's Lab @ UCLA) Funding National Agency for Science and Technology Promotion (ANPCyT, Argentina)