1 Igor I. Solar S.A.G.I. ResearchGenética y Biotecnología para el Mejoramiento Productivo de Organismos Acuáticos Igor I. Solar S.A.G.I. Research Octubre 28, 2008 AquaCiência 2008, “Aqüicultura: Desafios e Inovações”. Maringá, PR, BR.

2 Temario Definiciones – conceptosModificaciones genéticas – sentido amplio Programas de Selección OGMs – Ingeniería Genética Producción de un organismo transgénico Aplicaciones y beneficios de OGMs en acuicultura Organismos acuáticos transgénicos Riesgos ecológicos de OGMs Proceso de evaluación de riesgos de OGMs Mecanismos de contención de OGMs Detección de Poliploides y Transgénicos

3 En la naturaleza existe sólo un mecanismo de mejoramiento de las especiesAdaptación Evolución

4 ¡ Es un proceso que tarda millones de años !La evolución como mecanismo natural de mejoramiento tiene varias ventajas: Por medio de la selección natural permite la sobrevivencia de los individuos más aptos (adaptados a su ambiente). Por medio de cruzamientos al azar mantiene la variabilidad genética de los organismos. Por medio de la radiación adaptativa permite a las poblaciones ocupar nuevos ambientes. Sin embargo, desde el punto de vista productivo, la evolución tiene un serio inconveniente: ¡ Es un proceso que tarda millones de años !

5 Alternativas para acelerar el mejoramiento genético con fines productivos:Reproducción Artificial Programa de selección Hibridización Control de sexo Inducción de esterilidad (triploides) Transgénesis Biotecnología

6 Biotecnología: Definición amplia de biotecnología: Uso industrial de organismos vivientes (o partes de organismos vivientes) para producir alimentos, drogas y otros productos. Biotecnología moderna: Aplicación de principios científicos y de ingeniería en el proceso de materiales y agentes biológicos para proveer bienes y servicios.

7 Desarrollo de la BiotecnologíaBiotecnologías más antiguas: fermentación, hibridización de plantas y animales, selección y reproducción. Biotecnologías recientes: uso de enzimas o bacterias en aplicaciones como manejo de desechos, producción industrial, producción de alimentos, producción de compuestos farmacéuticos, remediación de contaminación en tierra o agua. Biotecnología moderna: incluye el uso de ingeniería genética que permite traspasar material genético de una especie a otra.

8 Organismo Genéticamente Modificado (OGM)Definiciones amplias: Un organismo cuya constitución genética ha sido alterada por cualquier método, incluyendo procesos naturales, ingeniería genética, clonación o mutagénesis. (Fuente: Human Genome Project Information; Celera Genomics PhRMA Genomics). Un organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce naturalmente en el apareamiento ni en la recombinación natural (Fuente: Directiva del Consejo de la Unión Europea 90/220/CEE).

9 Organismo Genéticamente Modificado (OGM)Definiciones restrictivas: Un organismo (planta, animal, bacteria, o virus) cuyo material genético ha sido alterado ya sea por duplicación, inserción o eliminación de uno o más genes nuevos, o mediante cambio de las funciones de un gene existente. (Fuente: Biotechnology Australia). OVM organismo vivo que posea una combinación nueva de material genético que se haya obtenido mediante la biotecnología moderna. (Fuente: Protocolo de Cartagena).

10 Resolviendo las diferencias:“Modificación Genética“ (MG). Un organismo es considerado genéticamente modificado si su material genético ha sido alterado mediante cualquier método. “Ingeniería genética“ (IG). Un organismo es considerado producto de ingeniería genética si su material genético ha sido alterado mediante uso de técnicas que permitan la transferencia directa o eliminación de genes del organismo. Estas técnicas se denominan ADN recombinante. (Fuente: CFIA - Canadian Food Inspection Agency).

11 Procesos que resultan en organismos genéticamente modificados (según la definición amplia)Reproducción artificial (pisciculturas). Programa de selección - mejoramiento genético. Inducción monosexo (sólo hembras) mediante “neomachos” (XX) , o sólo machos mediante “supermachos” (YY). Inducción de monosexo mediante herencia cromosómica uniparental (gino- o androgénesis).

12 Procesos que resultan en organismos genéticamente modificados (según la definición amplia) (Cont.)Inducción de poliploides (3n, 4n). Clonación (generación de réplica de un individuo a partir de una célula somática). Mutagénesis (inducción de mutaciones en el genoma). Fusión celular (inducción de heterokariotes).

13 Procesos que resultan en organismos genéticamente modificados mediante ingeniería genética (IG).Transgénesis: Conjunto de procesos que permiten la transferencia de un gen (transgén) a un organismo receptor (llamado transgénico), que generalmente puede transmitirlo a su descendencia. Permite asociación de genes no existentes en la naturaleza entre especies y entre reinos (*). Autotransgénicos (donante y receptor de la misma especie): Alotransgénicos (donante y receptor de especies distintas): Ghc +Ghc (chinook) Ghc + Ghc Salmón Chinook Salmón Chinook transgénico +Ghc (chinook) Ght Ght + Ghc Tilapia sp. Tilapia sp. transgénica (*) Fuente: Modificado de Monsanto Agricultura España.

14 Mejoramiento Genético mediante selección y cruzas dirigidasDesarrollo e implementación de un programa de manejo de reproductores y de selección para mejorar características biológicas y aumentar la eficiencia productiva de los organismos cultivados de acuerdo a las exigencias de mercado.

15 Programa de Selección Requiere de control humanoEstá basado en principios y conceptos de genética Mendeliana (G. Mendel ) Permite foco en características de importancia económica (fenotípicas o de comportamiento) Involucra un proceso sistemático y metodológico de manejo y selección artificial de reproductores y descendencias Requiere equipamiento e infraestructura especial Requiere de compromiso a “largo plazo” Requiere de sistema eficiente de identificación de peces y mantención de registros.

16 Características de importancia económica en salmónidosCrecimiento Resistencia a enfermedades Color de la carne Color de la piel (plateado) Edad de maduración Rendimiento cosecha (cantidad de grasa, tamaño de la cabeza)

17 Caso: Programa de Selección Salmónidos - ReproductoresCaracterísticas Objetivo: Primario: Crecimiento; Secundarios: Edad de maduración, robustez Genotipificación de los reproductores Extracción de ADN (aleta adiposa) Amplificación de ADN (PCR) Análisis de variabilidad genética Distancia genética entre reproductores Frecuencias alélicas en cada locus Determinación de Homocigocidad (Ho) Análisis de optimalidad de cruzas Generar descendencias con Ho igual o inferior a los progenitores. Mantener variabilidad; minimizar inbreeding (consanguinidad).

18 Genotipificación (Perfil Genético) de ReproductoresAmplificación simultánea (Multiplex) de 8 loci (STRs – Short Tandem Repeats) altamente polimórficos (13-44 alelos). Huella genética en 3 paneles (primers marcados con fluoróforos: FAM (azul); HEX (verde) y NED (amarillo). Poder de exclusión conjunto (todos los loci): Más de 700 reproductores (~300 ♀ y 400 ♂). Generación de familias 1:1 Locus Número Alelos Ssa2210 13 Ssa2201 28 Ssa2215 20 Ssa1605 16 Ssa2216 18 Ssa2213 23 Ssa1606 32 Ssa171 44

19 Multiplex Ssa – 8 STRs Ssa2210 Ssa2201 Ssa2215 Ssa1605 Ssa2216 Ssa2213100 pb 200 pb 300 pb 400 pb 500 pb 409 pb 489 pb 108 pb 156 pb 158 pb 262 pb Ssa2210 Ssa2201 Ssa2215 7 19 23 49 11 31 Ssa1605 83 pb 127 pb 1 16 196 pb 264 pb 443 pb 355 pb Ssa2216 Ssa2213 19 36 11 33 64 pb 188 pb 322 pb 494 pb Ssa1606 Ssa171 2 33 4 47 Fuente: TAAG Genetics, Santiago, Chile)

20 Análisis de variabilidad genética (Reproductores)Frecuencias alélicas (1 locus) Homocigocidad población Dendograma distancia genética

21 Análisis y diseño de cruzas óptimas (DOC).Simulación computacional Todas las posibilidades de cruzas entre machos y hembras disponibles Generación virtual aleatoria de 2000 descendientes y cálculo de homocigocidad global (Hog) de las progenies Selección de cruzas en que las progenies tendrían Hog igual o inferior a 0,20. Generación virtual de 50 descendientes de cada cruza realizada según DOC y cálculo de homocigocidad global (Hog) de las progenies. Reducción de Hog de 0,26-0,21 a 0,21-0,14 en las generaciones , respectivamente.

23 Datos ambientales, genéticos, de desempeño, rendimiento de cosecha.Selección de reproductores en base a antecedentes genéticos y desempeño fenotípico individual, familiar y poblacional. Datos ambientales, genéticos, de desempeño, rendimiento de cosecha. Progenitores Ambiente 30 % genética 70 % ambiente Contemporáneos Hermanos Potencial como reproductor (Valor de cría – EBV*) (Descendencia) Datos múltiples, de diversas fuentes, requieren análisis mediante Modelo Linear Mixto * Estimated Breeding Value

24 Mejoramiento productivo mediante ingeniería genética (transgénesis).Las principales aplicaciones de ingeniería genética en acuicultura están dirigidas a mejorar la eficiencia productiva (relación costo/beneficio): Aumentar crecimiento y/o conversión alimenticia (GhG). Aumentar tolerancia a variables ambientales (temperatura, AFPG [Ocean pout, Macrozoarces americanus] , salinidad) Mejorar características organolépticas de importancia económica. Controlar actividad reproductiva y/o fenotipos sexuales. Aumentar resistencia a patógenos/parásitos (IHNV). (Devlin et al, Nature 271: ) GhG: growth homone gene; AFPG: anti-freeze protein gene; IHNV: infectious hematopoietic necrosis virus)

25 Otras Aplicaciones y beneficios de organismos transgénicos en acuiculturaDesarrolladas o en investigación: Modificar comportamiento (agresividad). Control o eliminación de poblaciones ferales que constituyen plagas (IFG; Daughterless carp). Uso de peces transgénicos como monitores de contaminantes (GlowFishTM). Permitir uso de proteínas vegetales en peces carnívoros o aumentar capacidad de metabolizar carbohidratos. Uso de peces para la producción de productos farmacéuticos. IFG: Inducible fatality gene

26 Hitos en Ingeniería Genética de PecesAño Evento Autores 1984 Microinyección de secuencias clonadas de genes a ovas de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Maclean and Talwar, UK. 1985 Transferencia de genes a ovas de pez dorado (goldfish, Carassius auratus). Zhu et al, China 1987 Trasferencia de gen de hormona de crecimiento humana (HGhG) a bagre de canal (Ictalurus punctatus). Dunham et al., USA. 1988 Gen de proteína anticongelante (AFPG) de winter flounder (Pleuronectes americanus) transferida a salmón del Atlántico (S. salar). Fletcher et al., Canada 1994 Uso de gen recombinado (“all-salmon”) resulta en dramático crecimiento en salmón coho (Oncorhynchus kisutch). Devlin et al., Canada

27 Hitos en Ingeniería Genética de Peces1996 Rápido crecimiento de tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) transgénica Martínez et al., Cuba 1999 Producción de pez cebra transgénico (Danio rerio) con genes de coral fluorescente desarrollado para detectar toxinas en agua. Gong et al., N.U. Singapore 2001 Primer autotransgénico diploide y triploide en “mud loach” (Misgurnus mizolepis) con gen recombinado (“all- mud loach”). Kim et al., N.F.U. S. Korea 2003 Primer pez transgénico ornamental fluorescente (Pez cebra, Danio rerio) comercializado al público por una empresa de USA (GlofishTM). Yorktown Technologies, Texas, USA.

28 Producción de un organismo transgénicoB 2 1 3 4 5 6 7 EcoR1 A Organismo donante 3 Enzima de Restricción 6 Clonación de plásmido en bacterias 1 ADN de donante 4 Inserción (“splicing”) de gen en Plásmido (vector) 7 Inserción de plásmido en organismo receptor mediante microinyección o electroporación. 2 PCR (amplificación) 5 Plásmido con gene (hibridización) B Organismo transgénico con gen organismo donante Fuente: Modificado de

29 Organismos acuáticos transgénicos (Peces)Nombre común Nombre científico N (1) Salmón del Atlántico Salmo salar 6 Salmón Coho Oncorhynchus kisutch 4 Salmón Chinook Oncorhynchus tshawytscha 3 Tilapia Oreochromis spp. 12 Trucha del Ártico Salvelinus alpinus Medaka * Oryzias latipes 17 Pez Cebra * Danio rerio 14 Carpa Común Cyprinus carpio Bagre de Canal Ictalurus punctatus 9 Bagre Africano Clarias gariepinus 1 Trucha Arco-iris Oncorhynchus mykiss 7 Trucha de Clark Oncorhynchus clarki (1) Número de genes usados para generar transgénicos; (*) Uso experimental

30 Organismos acuáticos transgénicos (Peces cont.)Nombre común Nombre científico N (1) Pez dorado * Carassius auratus 5 Lucio (Northern pike) Esox lucius 2 Misgurno oriental (Loach) Misgurnus anguillicaudatus Misgurno de laguna (Mud Loach) Misgurnus mizolepis Dorada Sparus aurata Dorada Japonesa Pagrus major 1 Carpa de Wuchang Megalobrama amblycephala Carpa japonesa (Nigoro-buna) Carassius auratus grandoculis Lucioperca americana (Walleye) Sander vitreus Sábalo (Milkfish) Chanos chanos Lubina blanca Morone americanus (1) Número de genes usados para generar transgénicos; (*) Uso experimental

31 Organismos acuáticos transgénicos (Otros)Nombre común Nombre científico N (1) Crustáceos - Artemia Artemia franciscana 1 Camarón Kuruma Penaeus japonicus Algas Laminaria japonica Equinodermos - Erizo Strongylocentrotus purpuratus Moluscos – Abalón rojo Haliotis rufescens Abalón de Taiwan Haliotis diversicolor Almeja enana Mulinia lateralis (1) Número de genes usados para generar transgénicos Fuentes: Galli (2002); Beardmore and Porter (2003), Harper et al. (2003).

32 Riesgos ecológicos de organismos genéticamente modificados (sentido amplio)Modificación Riesgo potencial Nivel de Riesgo Reproducción artificial Disminución de “fitness” (viabilidad: sobrevivencia y reproducción) causada por manejo controlado de condiciones ambientales; Variación de frecuencias alélicas; Consanguinidad; Domesticación. Bajo a moderado Programa de Selección Disminución de “fitness” causada por manejo controlado de condiciones ambientales; Variación de frecuencias alélicas. Domesticación Bajo Poblaciones monosexo Variación de frecuencias alélicas; Consanguinidad (elevada en caso de monosexos uniparentales); Alteración de proporción de sexos en la población. Moderado Poliploides 3n Alteraciones reproductivas. Esterilidad variable en distintas especies. Hembras 3n estériles - machos funcionalmente estériles c/ comportamiento reproductivo. Insignif. en 3n todo-hembra Moderado en 3n sexo mixto Poliploides 4n Fértiles; generan triploides estériles Fallas reproductivas en poblaciones silvestres. Transgénicos Se discuten a continuación

33 Riesgos de organismos transgénicosLos riesgos pueden ser: Ambientales Sanitarios (salud humana) Socio-económicos Consideraciones éticas – Aceptación El nivel de riesgo no sólo depende de los OGM mismos sino también de otros factores: Solidez de sistemas de contención Habilidad adaptativa de los OGM al ambiente local Estado de las poblaciones locales Características del ambiente local

34 Riesgos de organismos transgénicosInteracciones intra-específicas (Cuando existen poblaciones silvestres de la misma especie). Ventajas competitivas si los OGM tienen mayor tamaño, resistencia a factores ambientales adversos, resistencia a enfermedades. Desplazamiento o extinción de poblaciones indígenas silvestres. Hibridización - Introgresión (infiltración de genes de una especie/población en el pool genético de otra) (Trojan gene effect).

35 Riesgos de organismos transgénicosInteracciones inter-específicas (sin introgresión de genes). Impacto en la comunidad acuática a través de: Expansión de hábitats Predación Competencia por recursos, espacio, alimento, protección. Transferencia de enfermedades y parásitos.

36 Descripción del RiesgoEvaluación de riesgo Riesgo es la probabilidad que la exposición a un peligro resulte en daño. Catastrófico Mayor Severo Moderado Menor Insignif. 5 4 3 2 1 Bajo Remoto Raro Extremo Alto Posible Probable Muy probable Nivel de Probabilidad Nivel de Consecuencia Descripción del Riesgo Fuente: Modificado de Fletcher et al. 2002

37 Contención de Organismos Genéticamente ModificadosTres niveles de contención: Limitar al organismo Limitar flujo de genes Limitar expresión de características transgénicas Mecanismos de contención: Contención física: prevenir entrada al ambiente Contención geográfica: prevenir sobrevivencia en el ambiente Contención biológica: evitar reproducción en el ambiente, transmisión y expresión del transgén. Poblaciones monosexo Triploides estériles GURTs (Genetic Use Restriction Technologies).

38 Variabilidad en los riesgosLa “liberación” del transgén y las características inducidas pueden tener consecuencias de mayor o menor severidad según su efecto en poblaciones silvestres o indígenas. Sistemas de cultivo y factores socio-económicos pueden influir de manera variable. Las medidas de contención aplicables pueden ser distintas para diferentes especies. Se requiere enfoque “caso a caso” en la evaluación de solicitudes de cultivo de especies trasngénicas. Se recomienda 3 a 5 barreras de contención, incorporando combinación de medidas físicas, geográficas y biológicas (1). Medidas de contención propuestas deben ser evaluadas por comité de expertos. (1) Scientists’ Working Group on Biosafety (1998) Manual for Assessing Ecological and Human Health Effects of Genetically Engineered Organisms

39 Detección de Poliploides y TransgénicosMicroscopía – tamaño de células - kariotipo Citometría de flujo – Cuantificación de ADN Detección de Transgénicos: Identificación de secuencias específicas de ADN Análisisis o Hibridización de Southern (Southern Blotting) Reacción en cadena de polimerasa (PCR Estándar) PCR cuantitativo RT (Q-PCR real time) Hibridización Fluorescente in situ (F.I.S.H.) Análisis de transcripción (“Expresión” de genes) Northern Blotting (RNA) PCR de Transcripción Inversa (RT-PCR)(RNA) Análisis de Proteínas (“Medición de productos”) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Radio-Immuno Assay (RIA) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Immunohistoquímica

40 Bridge in Morning's Mist - Stanley Park – Vancouver, B.C.MUITO OBRIGADO! Bridge in Morning's Mist - Stanley Park – Vancouver, B.C. Foto de: M. Jassak

41 Cosecha antes de maduraciónSistema de producción para la generación de poblaciones todo-hembra y hembras triploides. Cosecha según tamaño Reproductores Producción Cosecha antes de maduración Hembras Ovas normales Salmón todo-hembra Semen femenino Machos fenotípicos Tratamiento androgénico Población Todo-hembra Inducción de triploides Triploides

42 Generación de “supermachos” (YY) y poblaciones monosexo todo-machoEn organismos con sistema de determinación sexual Hembra XX – macho XY es posible generar machos homozigotos para el cromosoma Y ♂ XY XX X Y ♀ YY Estrógeno “Neohembra” Supermacho 50:50 25:75 0:100

43 Manipulaciones cromosómicas (inducción de poliploides (3n y 4n) – ginogénesis)Radiación Gino Haploide Diploide Normal Diploide Ginogenético Triploide Diploide Ginogenético Homozigoto Tetraploide Tratamiento temprano (*) Tratamiento tardío (**) (*) Interrumpe Meiosis II (**) Interrumpe Mitosis 1 Fuente: Modificado de Thorgaard & Allen, 1988

44 Plásmido Un plásmido es una molécula de ADN separada del ADN de cromosomas capaz de duplicación autónoma. Su forma es típicamente circular y con dos hebras. Los plásmidos ocurren generalmente en bacterias Fuente:

45 Microinyección de gen en óvuloUno de los métodos más comunes para incorporar genes (secuencias de ADN) foráneo en un organismo. Las copias del gen (generalmente en un vector) son inyectadas en el pro-núcleo del óvulo

46 Electroporación Método mecánico usado para introducir moléculas en una célula receptora a través de la membrana celular. El procedimiento consiste en uso de pulsos eléctricos que alteran temporalmente la capa fosfolípida de la membrana celular permitiendo moléculas grandes (como ADN) ingresar a la célula (Purves et. al., 2001). “poro” en la membrana celular Plásmidos ingresando a la célula

47 Efecto del gen Troyano Orizias latipes Modelo desarrollado por Muir and Howard (1999) según el cual las ventajas competitivas de los machos de medaka (Orizias latipes) transgénicos podrían causar extinción de una población silvestre. Según este modelo 60 machos transgénicos introducidos en una población silvestre de medakas causan su extinción en 40 generaciones. El modelo tiene detractores (Norman & Laight, 2000): No hay evidencia que expresión de los transgenes reduce la viabilidad de alevines y juveniles Asume que los adultos transgénicos de medaka son de mayor talla que el promedio de los medaka silvestres. En efecto hay mayor tamaño en juveniles pero no en los adultos. No siempre en la naturaleza los machos de mayor tamaño tienen ventajas reproductivas (“sneak mating tactics” de salmones, Gege et al, 1996)

48 Daughterless carp (*)(Carpa sin hijas)La técnica consiste en la inserción de un promotor que controla el gen que activa la producción de la enzima aromatasa que permite la conversión de andrógenos (testosterona) a estrógeno (estradiol). Durante el período de desarrollo embrionario el promotor inhibe la producción de la enzima lo que resulta en desarrollo de machos solamente. Aromatasa “Daughterless” gene Testosterona Estradiol Se espera que, por reducción gradual del número de hembras en la población, sería posible terminar con las carpas en Australia en años (*) Programa de CSIRO (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation) Australia.