1 Immunodiagnostyka chorób z autoagresjidr n. med. Joanna Makowska

2 Choroby z autoagresji Narządowo swoiste Choroba HashimooCh. Gravesa Basedowa Ch. Addisona Niedokrwistość złośliwa Poliendokrynopatie Cukrzyca Nieswoiste zapalenia jelit Nużliwość mięśni Stwardnienie rozsiane etc Narządowo nieswoiste Kolagenozy Toczeń Twardzina Zapalenie skórno-mięśniowe Zapalenia naczyń Niedokrwistość autoimmunohemolityczna

3 Diagnostyka chorób z autoagresjiPrzede wszystkim wywiad i badanie przedmiotowe !! W przypadku większości chorób z autoagresji wykrycie „markerów immunologicznych” – autoprzeciwciał jest pomocne ale nie jest konieczne do rozpoznania danej jednostki chorobowej

4

5 Kryteria rozpoznania RZSsztywność poranna trwająca minimum 1 godzinę utrzymująca się przez co najmniej 6 tygodni obrzęk 3 lub więcej stawów utrzymujący się przez minimum 6 tygodni obrzęk stawów nadgarstkowych, śródręcznopaliczkowych i międzypaliczkowych bliższych, utrzymujący się przez minimum 6 tygodni symetryczny obrzęk stawów, utrzymujący się minimum 6 tygodni typowe dla RZS zmiany w RTG guzki reumatoidalne czynnik reumatoidalny (RF) w surowicy

6 Zespół Churga StraussaAstma Eozynofilia >10% Mono lub polineuropatia Zagęszczenia miąższowe w płucach Nieprwidłowości w zatokach przynosowych Eozynofile obecne pozanaczyniowo

7 Dlaczego w diagnostyce głównie opieramy się na badaniu podmiotowym i przedmiotowymMała swoistość i czułość wykonywanych badań Brak szerokiej dostępności Niektóre przeciwciała występują w różnych jednostkach chorobowych (patrz ANA i ANCA) Obecność przeciwciał u osób z innymi nieautoimmunologicznymi chorobami: osoby starsze, przewlekłe zakażenia, nowotwory, krweni

8 Diagnostyka chorób narządowo nieswositychOznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych Oznaczanie przeciwciał przeciw cytoplazmie neutrofilów Biopsja

9 Immunofluorescencja

10 Immunofluorescencja bezpośredniaEmisja światła F F F F F F Ag Ag The fluorescence methods enables detecting marked cells using monoclonal antobodies conjugated with fluorochromes like FIT C, PE, PerCP. After incubation with antibodies we detect cells/ tissues in fluorescence microscope. We have 2 methods of immunofluorescence methods: direct and indirect. Direct immunofluorescence enables detecting antigens, complement components; antibodies marked by fluorochrome react with tissue after washing unbound antibodies out of the tissue is evaluating by fluorescent microscope. Tissue for biopsy- freezing, indications: pemphigus vulgaris- detection of autoantibodies bound to desmosomal areas Lupus erythematosus- lupus band test, IgG, C3, IgM, IgA in area of dermoepidermal junction Antygen tkankowy Przeciwciało Sprzężone z fluorochromem UV

11 Immunofluorescencja bezpośredniaLupus band test Ograniczenia: Fałszywie dodatni: trądzik różowaty…… Wykrywa obecność złogów immunoglobulin i dopełniacza na granicy skórno-naskórkowej osób z toczniem Lupus band test, it is one of the methods used in diagnosis of colagenosis systemic lupus erythoideus. We take skin biopsis from the skin changes from ( the best is to take from the skin exposed to sun light) . We detct immunoglubulin and C3 deposition at the dermo-epidermal junction of both lesional and normal skin . ( sensitivity 60% for SLE) after staining with fluorescein conjugated anti tibody to complement or immunoglobulin.

12 Wykrywanie rozpuszczalnychBadanie ANA Badanie ANA met. immunofluorescencji pośredniej na kom. Hep2 Wykrywanie poszczególnych przeciwciał Wykrywanie rozpuszczalnych Antygenów jądrowych ELISA Podwójna immunodyfuzja Western blott dsDNA- met immunofluorescencji pośredniej na Crithidium lucillae

13 Immunofluorescencja pośredniaSkoniugowane z fluorochromem przeciwciała F F F Przeciwciała w badanej surowicy + Ag Ag F F F Indirect IMF used in diagnosis of autoimmune diseases the antibody from the serum of patientreacts with substrate ( animal or humna tissue) ANA ANCA antiendomysial antibodies Antygen tkankowy (Hep-2, Crithidium lucillae, neutrofile) Ag UV

14 W jaki sposób oznaczamy obecność przeciwciał przeciwjądrowych?- Pobranie krwi - Wyizolowanie surowicy - Nałożenie surowicy na komórki Hep-2 Dodanie przeciwciał znakowanych fluoronchromem Odczytanie reakcji pod mikroskopem fluorescencyjnym

15 Co możemy zobaczyć pod mikroskopemTyp świecenia homogenny These are the patterns seen in fluorescence microscope - homogenous pattern Homogenous rim pattern speckled pattern, autoantibodies to extractable nuclear antigens Pattern charactersistic for many colagenosis Typ świecenia obwodowy Typ świecenia plamisty

16 Inne metody wykorzystywane w oznaczaniu autoprzeciwciałELISA- metoda immunoenzymatyczna Stała faza (dołek) Y Ag Antygen w fazie stałej Ig w Surowicy pacjenta Znakowane Ig

17 ELISA Na podstawie natężenia barwy i krzywej wzorcowej z wzrastającymi rozcieńczeniami można wyliczyć stężenie przeciwciał w badanej surowicy Reakcja Zmiana koloru Brak reakcji

18 Podwójna immunodyfuzja- wykrywanie ENACzęściowa zgodność antygenów Zgodność antygenów Radial immunodiffusion is using in clinical practice for to analyzed of proteins concentration in serum or another body fluids. Brak zgodności

19 Jak interpretować wynik badania przeciwciał przeciwjądrowych?Co to jest miano przeciwciał? Który pacjent ma dodatnie miano przeciwciał przeciwjądrowych pacjent A (wynik 1:80) czy pacjent B wynik 1 :640)? Czy przeciwciała przeciwjądrowe mogą występować u osób nie chorujących na choroby autoimmunologiczne?

20 Jak interpretować wynik badania przeciwciał przeciwjądrowych?Co to jest miano przeciwciał? Miano przeciwciał to największe rozcieńczenie surowicy badanej, w którym występuje reakcja antygen-przeciwciało Który pacjent ma dodatnie miano przeciwciał przeciwjądrowych pacjent A (wynik 1:80) czy pacjent B wynik 1 :640)? Pacjent B Czy przeciwciała przeciwjądrowe mogą występować u osób nie chorujących na choroby autoimmunologiczne? Tak: osoby po 70rż, kobiety w ciąży, osoby z WZWB, chorobami nowotworowymi, krweni osób chorujących na ch. Autoimmunologiczne, przelwkełe zakażenia etc

21 O czym mówią typy świecenia?

22 Typ świecenia obwodowy/homogenny

23 Typ obwodowy Typ świecenia obwodowy: charakterystyczny dla przeciwciał przeciw ds. DNA- toczeń układowy W celu potwierdzenia – wykonanie badania IF na Crithidium lucillae lub met ELISA Bardzo rzadko u osób zdrowych Czasem w niskich mianach u osób z twardziną i RZS Korelują z aktywnością choroby i odpowiedzią na leczenie Dobry marker aktywności choroby Wysokie miana- wzrost ryzyka nefropatii toczniowej

24 Crithidium lucillae

25 Typ plamisty- przeciwciała przeciw rozpuszczalnym antygenom jądrowym

26 Dalsze wykrywanie poszczególnych typów antygenów - metoda ELISA - immundyfuzji - Western blott

27 O czym mówią typy świeceniaTyp plamisty- rozpuszczalne antygeny jądrowe-ENA Sm 20-40% SLE Ro 40-95% 20-60% 100% Z. Sjogrena Toczeń noworodków La 10-20% z. Sjogrena Scl-70 25-75% Twardzina uogólniona Anty RNP 95-100% MCTD Anty Jo-1 25-35% Zapalenie wielomięsniowe antyPM/SCl 50-70% Twradzina z dermatomyositis Anty Mi-2 Zapalenie skórno-mięsniowe

28 Typ centromerowy Twardzina ograniczona

29 Przeciwciała Sm (kompleks rybonukleoproteiny)Swoiste dla SLE (u 30% pacjentów) Korelują z występowaniem zmian nerkowych i zmiany w OUN Przeciwciała antyfosofolipidowe Nieswoiste Czynnik ryzyka zakrzepów- zatorów, trombocytopenii i poronień Przeciwciała anty RNP 10-20% osób z SLE Korelują z psychozami, z zapaleniem mięśni

30 Przeciwciała przeciw Ro40% pacjentów z SLE Podostra skórna postać tocznia Korelują z nadwrażliwością na światło i włóknieniem płuc, zmianami hematologicznymi Nieswoiste również w zespole Sjogrena, RZS i twardzinie Toczeń noworodków Przeciwciała przeciw La 15% pacjentów z SLE Nieswoiste również w zespole Sjogrena, RZS i twardzinie

31 Przeciwciała przeciw histonomNieswoiste U 50% pacjentów z SLE Ponad 90% pacjentów z toczniem polekowym Izoniazyd Hydralazyna Prokainamid fenytoina

32

33 Przeciwciała mięśniowo specyficzneJo-1 syntetaza histydylowa tRNA- 20% dermatomyositis wiążą się z włóknieniem płuc, gorączką, objaw Raynauld, zapalenie stawów SRP- 5% pacjentów ciężka postać oporna na leczenie Ostry początek PM zajęcie mięśnia sercowego Mi % odpowiadająca na leczenie związana ze zmianami skórnymi

34 Zespoły nakładania MCTD- mieszana choroba tkanki łącznejSLE + twardzina + DM Przeciwciała U1RNP Twradzinopodobne zapalenie Mięśni Twardzina + polymiositis PM/Scl Zapalenie wielomięśniowe z przeciwciałami przeciw tRNA syntetazie DM+ twardzina+ włóknienie płuc Przeciwciała Jo -1 (przeciw tRNA syntetazie)

35 Przeciwciała przeciw cytoplazmie neutrofilówANCA

36 ANCA- przeciwciała przeciw cytoplazmie neutrofilówp-ANCA c-ANCA Głównie przeciw metyloproteinazie w zespole Churga Straussa mikroskopowe zapalenie naczyń kłębuszkowe zapelenia nerek Reakcje autoimmunologiczne polekowe Przeciw proteinazie 3 90% pacjentów z ziarniniakiem Wegenera Ale też Mikroskopowe zapalenie naczyń-40% Z Churga Strausa 10%

37 Przeciwciała antyfosfolipidowePrzeciwciała anty beta2-GPI, przeciw ptrombinie, przeciwciała antykardiolipinowe, antykoagulant toczniowy (LA)

38 Przydatność klinicznaZespół antyfosfolipidowy (małopłytkowość + zakrzepica +poronienia)- przeciwciała LA i przeciwciała antykardiolipidowe Małopłytkowość samoistna SLE Ich obecność- skłonność do zakrzepów

39 Czynnik reumatoidalnyPrzeciwciało klasy IgM (85%), rzadziej klasy IgG, IgA lub IgE skierowane przeciwko fragmentowi Fc własnego IgG Można go oznaczać w surowicy, płynie stawowym, płynie z j. osierdzia, opłucnej

40 Metody oznaczania RF Met. półilościoweOdczyn Waalera-Rosego- hemaglutynacja Odczyn lateksowy- aglutynacja Metody ilościowe Nefelometria ELISA (można oznaczać RF w różnych klasach)

41 Wartosc kliniczna RF w niskich mianach może być wykrywany w zdrowej populacji, zwłaszcza u osób starszych RF w pierwszych okresach choroby może być ujemny RF najwcześniej pojawia się w płynie stawowym, potem w surowicy

42 Kiedy RF może być dodatni?Choroby reumatyczne Przewlekłe choroby zapalne wątroby i płuc Choroby nowotworowe Zakażenia: AIDS, mononukleoza, gruźlica, trąd Stan po szczepieniu

43 Przyczyny wyników fałszywie ujemneBlokowanie reakcji przez endogenne IgG Bardzo duże stężenie RF Pacjent leczony sterydami

44 Przeciwciała przeciw cyklicznemu cytrulinowemu peptydowi (anty CCP)W zapaleniu dochodzi do cytrulinizacji białek wimentyny ( w makrofagach) i fibryny Zmodyfikowane białka tworzą antygeny przeciw którym produkowane są przeciwciała antyCCP Oznaczanie metodą ELISA

45 Przydatność kliniczna antyCCPCzułość 48% swoistość 98% Serologiczny marker wczesnego RZS Też u pacjentów z seronegatywnym RZS Mogą poprzedzać wystąpienie pierwszych objawów wiele lat Ich obecność- skłonność do powstawania nadżerek i aktywniejszej postaci choroby

46 Choroby narządowo swoiste

47 Przeciwciała przeciwtarczycowePrzeciw TSH receptorowi Przeciw tyreoperoksydazie Przeciw tyreoglobulinie

48 Przeciw receptorowi dla TSHTesty II generacji z rekombinowanym ludzkim rec dla TSH Metoda ELISA, RIA Przydatność kliniczna: Rozpoznanie choroby Gravesa- Basedowa (czułość 95%, swoistość 98%)- U pacjentów nie leczonych lekami przeciwtarczycowymi !! Rozpoznanie orbitopatii gdy nie towarzyszy jej nadczynność tarczycy W ciąży ocena ryzyka przejściowej nadczynności tarczycy u dziecka

49 Przeciw tyreoperoksydazieOdpowiadają kiedyś oznaczanym antymikrosmalnym Rozpoznanie autoimmunologicznego podłoża niedoczynności tarczycy (98%) Zapalenie autoimmunologiczne tarczycy przebiegające z eutyreozą Uwaga: też dodatnie w ch. Gravesa- Basedowa (70%)i podostrym zapaleniu tarczycy (10%) Czasem obecne u osób zdrowych (zwłaszcza starszych)

50 Przeciwciała przeciw tyreoglobuliniePomocnicza rola w diagnostyce autoimmunologicznego zapalenia tarczycy z niedoczynnością (gdy anty TPO ujemne) Weryfikacja oznaczeń tyreoglobuliny u pacjentów monitorowanych po leczeniu raka tarczycy

51 Przeciwciała przeciwwyspoweICA- przeciw różnym antygenom- oznaczanie met. Immunofluorescencji pośredniej Anty GAD65- przeciw dehydrogenazie kwasu glutaminowego IA-2, IA-2 beta- przeciw fosfatazom tyrozyny IAA Przeciw insulinie endogennej Metoda ELISA, RIA

52 Przydatność klinicznaPotwierdzenie rozpoznania tła autoimmunologicznego cukrzycy typu I (obecność 2 typów przeciwciał, wraz z upływem czasu miano Ig spada) Odróżnienie LADA od cukrzycy typu II Poszukiwanie osób o zwiększonym ryzyku rozwoju cukrzycy (badania naukowe, nie przydatne klinicznie)

53 Przeciwciała przecinadnerczoweChoroba Addisona- przeciwciała przeciw 21 hydroksylazie- nie mają dużego znaczenia klinicznego, inne przeciwciała przeciw 17 hydroksylazie i liazie nie są rutynowo oznaczane Podłoże autoimmunologiczne w 70-90% przewlekłej niewydolności kory nadnerczy

54 Przeciwciała przeciw receptorowi dla acetylocholinyMiastenia-u 75% chorych, zwłaszcza w przypadku uogólnionych objawów Wynik fałszywie dodatni Zespół miasteniczny Lambert-Eatona Grasiczak bez miastenii Leczeni penicylaminą Rak drobnokomórkowy płuca

55 Choroby wątroby Autoimmunologiczne zapalenie wątrobyTyp I przeciwciała ANA i przeciw mięsniom gładkim SMA- lepsze rokowanie, lepsza odp na GKS Typ II przeciwciała przeciw LKM1 (ant. Mikrosomalny wątroby i nerek)- bardziej agresywne, gorsza odpowiedź na GKS, często z innymi ch. autoimmunologicznymi Przewlekłe stawrdniające zapalenie dróg żółciowych p-ANCA 30-80% , też ANA i SMA Przewlekła marskość żółciowa- przeciwciała przeciw mitochondrialne- AMA %, ANA i SMA (20-30%)

56 Celikia Przeciwciała przeciendomysialne (immunofluorescencja)Przeciwciała przeciw translutaminazie tkankowej (ELISA) w klasie IgA (wyklucz niedobór IgA- wynik fałszywie ujemny) Kiedyś badano przeciwciała przeciw gliadynie ale zbyt mała swoistość i czułość- obecnie się nie wykonuje

57 Nieswoiste zapalenia jelitChoroba Leśniowskiego- Crohna- przeciwciała ASCA przeciw Saccharomyces cerevisae-60% Wrzodziejące zapalenie jelita grubego- pANCA-60%

58 Autoimmunologiczne zapalenie żołądka i choroba Addisona BiermeraIg przeciw czynnikowi wewnętrznemu czułość 70%, swositość>95% Ig przeciw komórkom okładzinowym- u 90% ale mniej swoiste niż anty IF

59 Dziękuję za uwagę