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2 INCIDENCE OF TYPE 1 DIABETES IN PEDIATRIC POPULATIONEpidemiología de la diabetes tipo 1. INCIDENCE OF TYPE 1 DIABETES IN PEDIATRIC POPULATION ( ) ↑ 6.2 3.4 Per insured as of June 30 of each year (2000 – 2010) Sources: SUAVE-Coordinación de Servicios Integrados de Salud Sistema Especial de Vigilancia Epidemiológica Gómez-Díaz RA, Pérez-Pérez G, Hernández-Cuesta IT, et at. Incidence of type 1 diabetes in Mexico: data from institutional register Diabetes Care 2012;35:e77

3 Genes de susceptibilidad para diabetes tipo 1Genes No-immunes Genes Immunes Bakay M, Pandey R , Hakonarson H DOI: /52435

4 Inmunidad innata y adaptativaLa respuesta autoinmune en diabetes tipo 1, se debe a una falla de los mecanismos reguladores de la inmunidad adquirida (que corresponden a expansión y/o función de linfocitos T reguladores) los candidatos son: los linfocitos T CD4+CD25+ y las células NKT. Inmunidad innata y adaptativa Respuesta rápida Respuesta lenta Berzins SP, et al. Presumed guilty: natural killer T cell defects and human disease. Nat Rev Immunol 2011; 11: Natural Killer Cells: Innate or Adaptive Immunity? Or Both? Ehrlich E, Mattiuz K. 2011

5 Las células NKT tienen las características de células NK y células T.Se ha propuesto que brindan protección natural contra algunas enfermedades autoinmunes de tal manera que defectos en la frecuencia y/o función estarían involucrados en desarrollo de DT1. Es similar a la célula NK ya que expresa : Son similares a la célula T por expresar:

6 Plausibilidad biológica: Modelo de ratón NOD: Defectos en el número y función.En el humano: Presencia o ausencia de defectos en número y función Células NKT Subconjunto de linfocitos T que expresa TCR   y CD3, CD161 y CD1d. Papel regulador de la respuesta inmune adaptativa Función: supresora natural contra células T anti-islotes y sus defectos juegan un papel importante y causal en el modelo de enfermedad del raton NOD. Al activarse producen citocinas (IL-4, IL-10, IL-12, IL-6, IFN, TNF α) moduladoras del sistema inmunológico. Presentan menor cantidad de NKT, y la administración de NKT impide desarrollo de DT1 Curr Opin Immunol 2001, 13: J Leukoc Biol 2000; 67:

7 Catepsinas regulan citotoxicidad de células T y células NK/CD8+Front Immunol Dec 2,2014 1Badano MN, et al. B-cell lymphopoiesis is regulated by cathepsin L. PLoS ONE 8:e61347. 2Zou F, et al. Regulation of cathepsin G reduces tha activation of proinsulin-reactive T cells from type 1 diabetes patients. PLoS ONE 2011;6:e22815. El gen CTSL regula negativamente la producción de células B1 Cathepsin-G ejerce un rol crítico en el procesamiento de la proinsulina y activa células T en diabetes2. Cathepsin L (CTSL) Es una proteincisteina lisosomal. Es responsable de la degradación intracelular de proteínas. Tiene un rol clave en la selección de las células T. Es un potencial regulador de las células NKT

8 Proteínas exógenas son endocitadas y degradadas por proteasas (Legumain, Cathepsin L y Cathepsin S ) que se encuentran dentro de los endosomas y lisosomas1. La deficiencia de Cathepsin-L protege de insulitis y progresión a diabetes en el modelo de raton NOD2 1Hsing LC, et al. The lysosomal cysteine proteases in MHC class II antigen presentation. Immunol Rev 2005 2Maehr R, et al. Cathepsin L is essential for onset of autoimmune diabetes in NOD mice.JCI 2005

9 Interaction between susceptibility and gene protectionInsulitis: β cells destruction Antibodies: IAA, GADA, ICAs, ZnT8A Loss of 1st phase of insulin response (IVGTT) Glucose intolerance Absence of C peptide Overt diabetes Time Pre-diabetes β cells mass Immune dysregulation Environmental triggers and regulators 10% 50% 100% ?? Target genes Other environmental factors Genetics Immune dysregulation? Viral infection A B C CD4 + T Cells CD8 + T Cells b NKT Cells z V a C g e d CD1d Glycolipid CRTAM Nectin-like 2 IFNg z V a b C g e d z V a b C g e d IFNg TNFa IL-1β INSULIN (B: peptide 9-23) IFNg MHC class I IAg7 MHC class II IL-12 b b Antigen Presenting Cell (APC) β-cell destruction Type 1 diabetes Gómez-Díaaz R., et al. Curr Diabetes Rev 2011;7(4):

10 Pregunta de investigación:Planteamiento del problema El papel de NKT en modelo murino está claro, pero en humanos los resultados son contradictorios. Las células NKT pueden polarizar su propia respuesta y la respuesta sistémica inmune. El gen CTSL ejerce un rol crítico en la selección positiva de las células NKT en diabetes tipo 1. Con el presente proyecto se pretende aportar conocimiento nuevo sobre la relación de las células NKT con la expresión del gen CTSL y su rol en la fisiopatología de la enfermedad en población pediátrica con diabetes tipo1. Además permitirá: Identificar a la población activada in vivo de células NKT. Caracterizar a la población pediátrica con diabetes tipo 1: conocer el estatus actual del % y # de células NKT, los haplotipos (HLA) y la respuesta humoral (Anti-GAD, Anti-IA2 y Anti-Insulina) al inicio de la enfermedad en pacientes y sus hermanos. Pregunta de investigación: ¿Existirá relación entre el nivel de expresión del gen CTSL con el porcentaje y # de células NKT en pacientes con diabetes tipo 1 de reciente inicio vs sus hermanos y controles sanos?.

11 Objetivo Comparar el nivel de expresión del gen CTSL y su asociación con el porcentaje y números absolutos de las células NKT en pacientes con diabetes tipo 1 de reciente inicio con sus hermanos y controles sanos. Hipótesis Existe correlación directa entre el nivel de expresión del gen CTSL y el porcentaje y números absolutos de células NKT en pacientes con diabetes tipo 1 de reciente inicio cuando se compara con el de sus hermanos y controles sanos.

12 Modelo conceptual Universo de trabajo Medición de Células NKTINSTITUCIONES PARTIPANTES MEDICIONES Y ANALISIS Medición de Células NKT Estudio genético Anticuerpos Insulina Péptido C HbA1c Tipificación de HLA Porcentaje % y #s absolutos Células NKT Gen CTSL HLA (DRB1*0405-DQA1-*0301-DQB1*0302) (Anti-GAD, IA2, Insulina) Servicios Endocrinopediatría HP CMN “SXXI” y HG CMN “La Raza” PACIENTES CON DIABETES TIPO 1 Hermanos CONTROLES SANOS RESULTADOS ESPERADOS CARACTERIZACION Y DETECCION TEMPRANA EN FAMILIARES DE PRIMER GRADO EN RIESGO PARA INICIAR MANEJO OPORTUNO GENERAR EVIDENCIA DE SU INVOLUCRO EN LA FISIOPATOLOGIA DE LA DIABETES TIPO 1 PUBLICACION DE RESULTADOS Asociación de células NKT con la expresión del gen CTSL en población pediátrica mexicana con diabetes tipo 1 de reciente diagnóstico. Gómez-Díaz RA, Medina-SantillánR, Bekker-Méndez C, et al. Gac Med Mex 2016;152:14-21 CINVESTAV UNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA EN BIOQUIMICA Y EPIDEMILOGIA CLINICA UI EN INMUNOLOGIA. INFECTOLOGIA LA RAZA ESCUELA BENITO JUAREZ “SEP” UNIDADES DE MEDICINA FAMILIAR DEL IMSS Universo de trabajo Modelo conceptual

13 Material y métodos DISEÑO: Transversal analítico.UNIVERSO DE TRABAJO: Servicios Endocrinopediatría CMN Siglo XXI y “La Raza” CRITERIO DE INCLUSIÓN Previo consentimiento informado: 1) Pacientes (>2 y <17años) con diabetes tipo 1: criterios de la ADA*: Cuadro clínico (poliuria, polidipsia y pérdida de peso inexplicable, cetoacidosis) Parámetros bioquímicos (glucemia de ayuno > 126 mg/dl confirmada en un día diferente) ó una glucemia en cualquier momento del día > 200 mg/dl, (sin considerar el tiempo de la última comida) Que amerite la aplicación insulina para su manejo. Menos de 3 meses de evolución 2) Familiares 1er. Grado de pacientes: Hermanos 3) Controles sanos de misma edad y género CRITERIOS DE NO INCLUSION Pacientes con diagnóstico de diabetes tipo 2, MODY, neonatal y secundaria. Controles con antecedentes de diabetes o alguna enfermedad auto-inmunitaria. (LES, AR, etc.). *Diabetes Care 2011;34:S61-62.

14 Algoritmo de procedimiento: Células NKTSangre periférica Obtención de RNA Pacientes con diabetes tipo 1 y controles sanos de la misma edad y género Expresión del gen HbA1c, glucosa, Insulina, Péptido C Anti-GAD, anti-IA2, anti-Insulina Gradiente Ficoll Hypaque Obtención de DNA HLA Clase II (DRBI, DQA1, DQBI) Va24 Vb11 Células mononucleares Hermanos de pacientes Anti CD3, anti V24, anti V11 Citometría de flujo Análisis de la población de células NKT Los números absolutos de la población NKT se calcularan utilizando la siguiente fórmula: Células NKT/mL: Leucocitos X %Linfocitos (en la BH) X % células NKT (en la citometría de flujo) X 1000

15 Material y métodos Células NKT Auto-anticuerpos(Anti-CD3, anti-V24, anti-V con anticuerpos comerciales) por citometría de flujo. Células NKT (% y números absolutos) La expresión del gen CTSL: OpenArray Real Time PCR Instrument (Applied Biosystem, Foster City, CA). Auto-anticuerpos (Anti-GAD, anti-IA2, anti-insulina) kits comerciales con técnica de ELISA HLA Clase II Haplotipo de Riesgo: DRB1*0405, DQA1*0301, DQB1*0302 De Protección: DRB1*0501,DQA1*0102, DQB1*0602 Tipificación: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA CON PRIMERS ESPECIFICOS DE SECUENCIA (SSP Unitray ® Pel-freez Dynal Biotech, USA) Insulina y péptico C por técnica de RIA BHC, glucosa, HbA1c. analizador Synchron CX (Beckman Systems, Fullerton, CA)

16 Tamaño de la muestra  = 0.05% Poder estadístico (1-) = 80%Utilizando los datos reportados por Kukreja A y cols. Media de porcentaje: 0.74% Controles 0.30% DM 1 Utilizando la formula para medias en grupos independientes n = 2 { [ ( Zα – Zβ ) σ ] / (μ1 - μ2) } 2 Donde: Zα = 1.96 Zβ = -0.84 μ1 = 0.74% μ2 = 0.30% Se requieren de 31 sujetos por grupo. *Kukreja A et al. J Clin Invest 2002; 109:

17 Aspectos estadísticosAnálisis descriptivo: Prueba de Kolmogorov-Smirnov: para conocer la distribución de los datos ANOVA o Kruskal-Wallis para comparar la media de las células NKT entre los grupos Prueba “t” para muestras independientes para comparacion entre grupos por pares. prueba X2 para el porcentaje y números absolutos de las células NKT entre dos grupos. Rho de Spearman para la correlación de las variables de interés entre los grupos. “p” < 0.05, SPSS 16.0 El análisis de amplificación de los resultados del gen CTSL: Programa OpenArray Real Time qPCR analysis software. Para el análisis de expresión del gen CTSL se creo un archivo .GCT para las muestras (columnas) que pasaron el filtro de calidad: el valor máximo de error del 20% (valor de expresión 10). Las muestras que no pasaron el filtro de calidad se descartaron del análisis. Se utilizó el módulo Comparative Marker Selection para calcular y comparar la significancia entre los grupos.

18 Consideraciones éticasAprobado por la CNIC ( ) Riesgo mínimo (punción en vena antecubital del brazo) Consentimiento informado Asentimiento informado en > 8 años Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud y Aspectos éticos de la investigación en seres humanos, Título II, Capítulo I, artículo 17 Financiamiento CONACYT (FIS/IMSS/PROT/640 CONACYT.SALUD, proyecto 87852).

19 Hermanos de pacientes con DT1Resultados Características antropométricas de los sujetos estudiados. Variable Pacientes con DT1 Controles Sanos Hermanos de pacientes con DT1 p n 48 32 44 Edad (años) 9.30 ± 3.85 (2-16) 9.56 ± 4.72 (2-16) 13.61 ± 6.78 (3-27) <0.001‡ Sexo (M) 23 (47.9%) 14 (43.8%) 19 (43.2%) 0.365◊ Peso (sz) 0.106 ± 1.04 ( ) 0.11 ± 1.05 (-1.88–2.21) 0.36 ± 0.84 ( ) 0.343¥ Talla (sz) ± 1.09 ( ) 0.38 ± 1.5 (-2.17 – 3.70) 0.032 ± 1.31 ( ) 0.332¥ IMC (sz) 0.208 ± 1.10 ( ) -0.93 ± 1.27 (-3 – 2) 0.31 ± 1 ( ) 0.311¥ TAS (sz) -1.36 ± 0.63 ( ) -1.32 ± 1 ( ) -1.23 ± 0.66 ( ) 0.741¥ TAD (sz) -0.16 ± 0.63( ) ± 0.77 (-1.44–1.64) 0.10 ± ( ) 0.204¥ M: Masculino. sz: valor z de las tablas de la CDC. TAS: Tensión arterial sistólica. TAD: Tensión arterial diastólica. +: positivos. ¥:ANOVA. † :T de Student. ‡: Kruskal Wallis. ◊: Chi cuadrada

20 Características bioquímicas y genéticas de los sujetos estudiados.Variable Pacientes con DT1 Controles Sanos Hermanos de pacientes con DT1 p n= 48 32 44 HbA1c (%) 7.65 ± 1.95 ( ) 5.35 ± ( ) 5.20 ± 0.88 ( ) <0.001‡ Insulina ng/mL 22.78 ± 21 ( ) 16.24 ± (2-107) 13.3 ± 5.97 (5-29) 0.045‡ Péptido C ng/mL 0.89 ± 0.781(0-3) 2.01 ± 9.23 (0-50) 1.64 ± (0-4) GAD65 (casos +) 28/46 (60.8%) 2/31 (6.3%) 1/43 (2.3%) <0.001◊ IA2 (casos +) 27/44(61.3%) 1/31 (3.1%) 5/38 (11.4%) 0.005◊ Anti-insulina (casos +) 21/44 (47.7%) 1/32(6.2%) 15/29 (34.1%) 0.631◊ Dos o más anticuerpos 18/47 (38.2%) 0/32 (0%) 2/44 (4.5%) HLA II protector 9/46(19.6) 4/31(12.9) 14/44(31.8) 0.130◊ HLA II de riesgo 38/46(82.6) 26/31(83.9) 37/44(84.1) 0.980◊ % células NKT 0.176 ± 0.202 ( ) 0.118 ± 0.133 ( ) 0.246 ± 0.188 ( ) 0.002‡ # absolutos células NKT ± ( ) ± ( ) ± ( ) 0.005‡ +: positivos. ¥:ANOVA. † :T de Student. ‡: Kruskal Wallis. ◊: Chi cuadrada

21 Se observan diferencias significativas entre los pacientes con diabetes tipo 1 y sus hermanos vs grupo control 5 4 3 Unidad expresión relativa CTSL 2 1 Control Hermanos de pacientes Pacientes Comparación de la expresión del gen CTSL entre hermanos y pacientes.

22 Existe correlación positiva entre la expresión del gen CTSL y el % y# absoluto de células NKT en pacientes con diabetes tipo 1. A 0.4 0.3 Unidad expresión relativa CTSL 0.2 B 0.4 0.1 0.3 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Unidad expresión relativa CTSL 0.2 % células NKT 0.1 0.0 0.0 500 1000 1500 2000 # absoluto de células NKT A: porcentaje de células NKT (r=0.4540, IC95% p=0.0452); B: Número de células NKT (r = , IC95%: , p =0.043)

23 C D Correlación de la expresión del gen CTSL con células NKT enhermanos de pacientes con diabetes tipo 1 C D Unidad expresión relativa CTSL Unidad expresión relativa CTSL *r= , IC95% – , p = % células NKT # absoluto de células NKT *r= , IC95% – , p = *Rho de Spearman

24 Conclusiones Existe una disminución en el porcentaje y números absolutos de células NKT entre pacientes con diabetes tipo 1 de reciente diagnóstico cuando se compara con sus hermanos. El porcentaje y números absolutos correlacionaron con niveles bajos de expresión del gen CTSL en pacientes con diabetes tipo1. Estos hallazgos apoyan su involucro en la fisiopatología de la diabetes tipo 1.

25 Agradecimientos Dra. Elisa Nishimura Meguro, Dra. Eulalia Garrido Magaña Servicio de Endocrinología, UMAE HP CMN “Siglo XXI” Dra. Blanca Elena Castro Moguel UI Médica en Enfermedades Infecciosas Dra. Lorena Lizárraga Paulin, Dra. Blanca E. Aguilar Herrera Servicio de Endocrinopediatría, UMAE Hospital General. CMN “La Raza” Dra. Carolina Bekker Méndez UI Médica en Inmunología e Infectología, HI Daniel Méndez Hernández “La Raza”. IMSS Dr. Vianney Ortiz Navarrete, Dra. Nonantzin Alicia Beristain Covarrubias, Dra. Elsy Canché Pool Departamento de Biomedicina Molecular, CINVESTAV Dr. Roberto Medina Santillán Escuela Superior de Medicina, IPN Dr. Miguel Cruz López, Dr. Jaime Gómez Zamudio, Dr. Adán Valladares Salgado UI Médica en Bioquímica UMAE Hospital de Especialidades CMN “Siglo XXI” M.enC. Rafael Mondragón González Dr. Niels H. Wacher Rodarte UI Médica en Epidemiología Clínica, UMAE Hospital de Especialidades CMN “Siglo XXI”