1 INFECCION POR HHV6 EN TRANSPLANTADOS RENALES:UNA CONTROVERSIA EN EL DIAGNOSTICO Julieta Giménez Carolina Carrizo
2 Introducción Infection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas Transplant Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4: Hombre, 29 años Enfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo I Serología pre-Tx Positivo Negativo CMV HSV VZV EBV HHV-6 Treponema palidum Toxoplasma gondii HCV HBV HIV Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:
3 Caso Clínico El procedimiento quirúrgico se realizó sin inconvenientesProfilaxis: Trimetoprima – sulfametoxasol Ganciclovir Alta 13 días post-trasplante Crea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dl Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:
4 Progresión a normalizar las EzCaso Clínico Días post-Tx GB (cel/mm3) Hb (mg/dl) Plq (/mm3) 17 22 34 61 9100 10.5 145000 3100 - 100 7 M U E R T AST (UI/ml) ALT (UI/ml) FAL (UI/ml) GGT (UI/ml) 122 222 317 92 864 1153 1186 416 Progresión a normalizar las Ez Cultivos sangre y orina LCR Sangre Otros pp65 (-) Biopsia Hp HHV-6 por PCR Serologías Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:
5 HHV-6 Generalidades Familia Herpesviridae, subgrupo BetaherpesvirinaeDNA lineal doble cadena ( Kb) Nucleocápside icosahédrica ( nm) Envoltura glicoproteica Variantes A y B (90% de homología) De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,
6 CD46: en todas las células nucleadasHHV-6 Generalidades CD46: en todas las células nucleadas Tropismo celular: Cerebro Glándulas salivales Hígado Endotelio Monocitos Células progenitoras de MO LATENCIA De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,
7 HHV-6 Generalidades Infección primariaNiñez (6 meses – 1 año) % Sexta enfermedad Reinfección o reactivación en huesped inmunocomprometido Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 % Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 % Reinfección o reactivación en huesped inmunocompetente De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,
8 Pruebas Diagnósticas IFI Serología ELISA Cultivo convencionalAislamiento Cultivo convencional Shell vial (cultivo rápido) PCR Cualitativa (linfocitos o plasma) Semicuantitativa Cuantitativa Cuantitativa en tiempo real Antigenemia Detección de Ag específicos en células mononucleares de sangre periférica Inmunohistoquímica (IHC) p101 (HHV-6B) gp82 (HHV-6A) Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32
9 Serología Permite la detección de infección latente o seroprevalenciaPoblación adulta > 90% seropositivos Infección primaria: 4 veces IgG IFI ó 1.6 veces IgG EIA Dockrell et al, Transplantation 1999 Lautenschlager et al, Clin Infect Dis 1998 Saxinger et al, J Virol Methods 1988 La detección de IgM es más controversial ya que puede producirse tanto en infecciones primarias como en reactivaciones Dockrell et al, Transplantation 1999 Desventajas: NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS
10 Aislamiento viral Cultivo convencional:Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de cordón umbilical activados y tratados con IL-2 Técnica laboriosa (5 – 21 días) Singh et al, Ann Inter Med 1996 Shell Vial: Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la detección de antígeno viral a las hs. Singh et al, Ann Inter Med 1996 Singh et al, Transplantation 1997
11 PCR Técnica rápida Elevada Sensibilidad PCR cualitativaValor limitado en la correlación clínica y la infección activa Secchiero et al, J Infect Dis 1995 Singh et al, Ann Inter Med 1996 Dockrell et al, Rev Med Virol 2001 PCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCR Permite detectar infección activa y distinguir entre variantes Secchiero et al, J Clin Microbiol 1995 Kidd et al, J Virol Methods 1998 Emery et al, Clin Infect Dis 2001 Gautheret –Dejean et al, J Virol Methods 2002
12 Resumen - + +/- ++ ++++ Latencia Infección Activa Célula no infectadaCélula infectada productiva Respuesta a la terapia Reactivación Expansión Latencia Infección Activa Aislamiento viral - + PCR cualitativa plasma PCR cualitativa leucocitos +/- PCR cuantitativa leucocitos ++ ++++
13 Frecuencia de HHV-6 postTx de MO Método Muestra n Inf. activa (%) Estudio PCR PCR,IHC qPCR Cultivo GB y BAL GB y plasma GB GB, orina y saliva GB y piel GB y LCR 41 92 22 61 37 57 74 20 82 26 25 46 42.5 60 28 ND 78 38 48 Takatsuka et al (2003) Imbert-Marcille et al (2000) Maeda et al (1999) Chan et al (1997) Wang et al (1996) Wilborn et al (1994) Appleton et al (1995) Ljungman et al (2000) Cone et al (1999) Yoshikawa et al (2002) Yoshikawa et al (2001) Kadakia et al (1996) Yoshikawa et al (1991) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,
14 Frecuencia de HHV-6 post Tx renales y renopancreáticosMétodo Muestra n Inf. activa (%) Estudio PCR qPCR PCR, Serología Cultivo, Serología GB Orina y suero 107 52 30 32 65 ND 23 50 31 55 Pacsa et al (2003) Kidd et al (2000) Ratnamohan et al (1998) Herbein et al (1996) Yoshikawa et al (1992) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,
15 TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA? TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA para detectar infección por HHV-6 Volin et al, British Journal of Hematology, 2004
16 UN MÉTODO DE CULTIVO PARA DIAGNÓSTICO DE HHV-6
17 Objetivos Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes trasplantados Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los mismos pacientes mediante Nested PCR
18 Pacientes trasplantadosMateriales y Métodos Total de muestras: 31 Leucocitos (obtenidos por dextran) 31 Plasma Pacientes trasplantados (15) Renales (13) Renopancreáticos (2) Serología IgG HHV-6 : 14 (+), 1 (-) Antigenemia pp65 : 15(-)
19 Pacientes trasplantadosDiagrama de trabajo Muestras de Pacientes trasplantados Leucocitos Shell vial Nested PCR Plasma
20 previamente acondicionadosMateriales y Métodos Shell Vial 200 ul de leucocitos previamente acondicionados Centrifugación 1 h – 2200 rpm 37º C 48 hs 1) Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa Presencia de Antígeno AcMo ARGENE 2) IFI Ac Antiratón marcado
21 Materiales y Métodos Nested PCR1) Extracción de ADN Columnas comerciales (Qiagen) 1er producto de amplificación 520 pb 2do producto de amplificación 258 pb Termociclador: Abbot LCX 2) Amplificación 3) Electroforésis 258 pb Secchiero et al. J Infect Dis.1995;171:273-80
22 1º Producto de amplificación (520 pb)Nested- PCR Secuencia Target Primer Ext. 1º Producto de amplificación (520 pb) Primer Int. 2º Producto de amplificación (258 pb) Sensibilidad : DICT 50 / ml
23 Nested- PCR Muestra: Plasma Gel de agarosa 2% 258 pb
24 Detección de HHV-6 en Tx
25 Paciente 1 Sexo masculino, 54 años Causa de Tx:Insuficiencia Renal Crónica secundaria a poliquistosis (desde 35 años) Transplante renal con donante vivo relacionado NEGATIVO POSITIVO Serología pre-Tx ND CMV, HSV I y II, EBV CMV HCV, HBV, HIV , HHV-6 Donante Receptor ND: no disponible
26 Paciente 1 El paciente evoluciona favorablementeSe lo controla por consultorio externo a partir de la 2da semana pos-Trasplante Sin datos clínicos relevantes
27 CONCLUSIONES 1- La frecuencia de detección de HHV-6 en leucocitos por PCR fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección activa en 5 de los pacientes estudiados 2- La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no se encontraron síntomas clínicos asociados a enfermedad por HHV-6 3- En 1/25 (4%) el Shell vial fue positivo con PCR positiva en la misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió infección primaria pos-trasplante. Esto no se correlacionó con enfermedad
28 CONCLUSIONES 4- El Shell vial es una alternativa complementaria a las técnicas moleculares para detectar la infección activa por HHV-6 5- Son necesarios estudios en forma longitudinal y prospectiva con mayor número de pacientes evaluandolos a diferentes tiempos Pos-Trasplante con el fin de definir un algoritmo diagnóstico para la infección activa por HHV6.
29 Agradecimientos Dra en Biología Cristina VidelaBioq. Alfredo Martínez Dra en Biología Cristina Videla Servicio de Virología (CEMIC)
30 ¡ MUCHAS GRACIAS !