1 Inicio de la transcripciónLa cromatina RNA polimerasas Factores de transcripción Activadores - reguladores La maquinaria proteica Inicio de la transcripción Promotores Enhancers Elementos “cis” Elongación – Procesamiento del transcripto primario Exportación

2 A significant difference between the transcription of eukaryotic and prokaryotic mRNAs is that initiation at a eukaryotic promoter involves a large number of factors that bind to a variety of cis-acting elements.

3 El proceso de transcripción en Eucariotes

4                                                                                               Nature 269, (06 October 1977); doi: /269527a0 The mechanism by which actinomycin D inhibits protein synthesis in animal cells HERBERT L. COOPER & RICHARD BRAVERMAN Section on Cellular and Molecular Physiology, Laboratory of Pathophysiology, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland 20014 IN the course of studies on the regulation of protein synthesis during the activation of human lymphocytes by phytohaemagglutinin (PHA), it became necessary to determine whether an effect which occurred following treatment with actinomycin D (AMD) was secondary to the action of the drug on transcription, or resulted from a direct effect on translation. Using enucleated lymphocytes, we have shown that AMD has no effect on protein synthesis in the absence of the cell nucleus and conclude that AMD interferes with protein synthesis by its effect on transcription of RNA.                                         

5 La transcripción de un gen eucariota codificante de proteínas es precedida por múltiples eventosDecondensación del locus Remodelado del nucleosoma Modificaciones de histonas Unión de activadores transcripcionales y coactivadores a enhancers y promotores Posicionado de la maquinaria basal de transcripción al promotor

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8 Las células eucarióticas poseen 3 tipos de RNA polimerasas en el núcleoResponse to the bicyclic octapeptide α-amanitin. RNA polymerase II is rapidly inhibited by low concentrations of α-amanitin. RNA polymerase I is not inhibited. The response of RNA polymerase III to α-amanitin is less well conserved; in animal cells it is inhibited by high levels, but in yeast and insects it is not inhibited.

9 pol I rRNA ribosoma RNApol II DNA proteína mRNA pol III tRNA

10 La RNA pol II de levadura y de humano son virtualmente idénticas12 subunidades 53 % de identidad se pueden intercambiar subunidades (10)

11 Maquinaria de transcripción de la RNApol IIDNA unwinding pol II RNA polymerization GTFs Promoter recognition Mediator Response to regulators

12 GTFs enables promoter recognition and initiationpol TATA 25 bp

13 General Transcription FactorsTFII subunits mass similarity to human B % D (TBP) % (TAFs) E % F % H %

14 El complejo “mediator” es necesario para la regulaciónenhancer activator mediator pol TATA 25 bp Fue descubierta en levadura como una fracción cruda necesaria para la respuesta “in vitro”

15 Transcripción por RNA pol II

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18 Proteínas con “dedos de Zn”Los factores de transcripción se suelen clasificar según el tipo de dominio de fijación al DNA que contienen Proteínas con “dedos de Zn” TFIIB, GAL4

19 Los factores de transcripción se suelen clasificar según el tipo de dominio de fijación al DNA que contienen Proteína con cremallera de leucina Proteína con hélice-bucle-hélice Proteínas de homeodominio c-fos and c-jun (the AP1 transcription factor), important regulators of normal development, as well as myc family members including myc, max, and mdx1. If they are overproduced or mutated in a vital area, they may generate cancer. These proteins interact with the DNA as dimers (homo- or hetero-) and are also called basic zipper proteins (bZips).

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22 Ver simulación del proceso de transcripción en

23 maquinaria basal de transcripciónIncluye los elementos de ADN que se extienden 35 bp upstream y/o downstream del sitio de iniciación de la transcripción. Muchos interaccionan directamente con componentes de la maquinaria basal de transcripción. Núcleo del promotor (“core promoter”) Factores que son mínimamente esenciales para la transcripción (inclusive la RNA pol II) maquinaria basal de transcripción

24 Propiedades de los elementos promotores de la RNA polimerasa II(PROPERTIES OF RNA POLYMERASE II CORE PROMOTER ELEMENTS)

25 TATA Box (Goldberg-Hogness box)Secuencia TATAAA presente a 25 to 30 bp upstream de +1 PREVALENCIA: En Drosophila 43% de 205 promotores

26 RECONOCIMIENTO DE TATARoeder y colegas: transcription factor IID, TFIID es esencial para la transcripción a partir de promotores TATA. TFIID es un complejo TBP (proteína de reconocimiento) A binding site selection analysis identified the sequence 5-TATATAAG-3 as the optimal TBP recognition sequence. TBP-associated factors (TAFs), actividades acetil transferasas quinasas, activadoras y conjugantes de ubiquitina

27 TFIIB y RNA polymerasa II determinan la distancia a +1TATA Box Rol de TATA en la direccionalidad de la transcripción +1 TATA ATAT +1 En un promotor que contiene sitios de unión distales para activadores La inversión del TATA box no produce un cambio en la dirección de la transcripción El principal determinante de la direccionalidad sería la disposición relativa de los sitios de unión de activadores, el TATA box y otros componentes del núcleo promotor TFIIB y RNA polymerasa II determinan la distancia a +1

28 Inr Initiator Element Py Py A(1) N T/A Py PyEl elemento iniciador (Inr) fue definido como un elemento discreto del núcleo promotor que es funcionalmente similar a TATA box y puede actuar independientemente Espaciado TATA-INR y direccionalidad de la transcripción 15 or 20 bp se mantiene el sinergismo pero el +1 lo dicta el TATA box 25-30 bp los dos elementos actúan sinérgicamente > 30 bp actúan independientemente La inversión de Inr en el contexto de un promotor conteniendo sitios de unión para activadores, no cambia la dirección de transcripción

29 Inr TFIID interacciona específicamente con Inr La acción sinérgica de TATA y Inr correlaciona con la unión cooperativa de TFIID a los dos elementos TFIIA es indispensable para la unión de TFIID a Inr RNA polymerasa II reconoce ADN inespecíficamente, sin embargo posee una débil e intrínseca preferencia por secuencias de tipo Inr.

30 DPE Downstream Promoter Element (DPE) El DPE actúa conjuntamente con Inr, La secuencia principal de DPE está localizada a 28 to 32 nt del A 1 en el motivo Inr Un promotor dependiente de DPE contiene Inr y DPE Mutaciones en cualquiera de los dos elementos resultan en la pérdida de unión de TFIID y de actividad basal de transcripción

31 TFIIB humano reconoce una secuencia de 7-bp: G/C G/C G/ACGCCBRE TFIIB Recognition Element (BRE) TFIIB humano reconoce una secuencia de 7-bp: G/C G/C G/ACGCC El reconocimiento es mediado por un motivo HTH del C-terminal de TFIIB Este motivo no existe en levaduras ni plantas lo cual sugiere que BRE no contribuye a la regulación génica en ellos

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33 CpG Islands CpG IslandsEl dinucleótido CpG es poco frecuente en genomas de vertebrados debido a que 5-metilcitosina puede transformarse en timina (por desaminación) el cual no es reparado Existen segmentos de ADN de 0.5–2 kbp que poseen una alta densidad de dinucleótidos CpG. El genoma humano contiene 29,000 islas CpG En mamíferos la mitad de los promotores codificantes de proteínas están asociados con CpG Las islas CpG carecen de TATA boxes, DPE o Inr . Se caracterizan por la presencia de múltiples sitios de iniciación de la transcripción que abarcan una región de 100 bp o más presentan múltiples sitios de unión para el factor de transcripción Sp1

34 These structures provide for the first time unequivocal evidence of the RNA polymerase II elongation complex a discrete RNA exit groove located near the base of the largely unstructured carboxy-terminal domain (CTD) accepts the nascent transcript as it is separated from the coding strand of the DNA template 10 nucleotides upstream of the transcript’s 3-end A maximum of 4 base pairs of unwound template DNA ahead of the 3-OH terminus of the growing transcript 9 base pair RNA-DNA hybrid that holds the newly synthesized transcript in register with the DNA template

35 The most notable structural difference between free and transcribing RNA polymerase II is the position of a large, 50 kDa hinged region referred to as the “clamp” In free polymerase is in an open conformation that would allow easy entry of the DNA template into the catalytic site. In the elongating enzyme, closes tightly over the DNA and nascent transcript.

36 mRNA is synthesized in cells, on chromatin templates, at rates approaching 2000 nucleotides per minute. Purified RNA polymerase II is capable of elongating RNA chains in vitro, even on naked DNA templates, at rates of only 100 to 300 nucleotides per minute

37 ¿Cómo es el proceso de elongación?¿Por qué se requieren de factores de elongación?

38 La RNA polimerasa II durante la elongación a cada paso de agregado de nucleótido oscila entre las conformaciones activa e inactiva (pausa) En algunos sitios del molde de ADN, la RNA pol “en pausa” es detenida, esa situación puede ser revertida sólo por factores de elongación (SII) La detención y la pausa sería el resultado de un movimiento en retroceso (2 – 4 nt) de la enzima y de la burbuja de transcripción Pausa reinicio detención El extremo 3´-OH no es aceptor del ribonucleótido trifosfato entrante. Luego de un tiempo la enzima espontáneamente se desliza hacia delante y el extremo se realinea con el ion Mg catalítico, continuando la síntesis. La RNA detenida resulta de un retroceso irreversible de 7 to 14 nucleótidos

39 TFIIF TFIIF was initially identified and purified as an essential RNA polymerase II initiation factor that is required for stable binding of polymerase to TFIID and TFIIB at the promoter and for entry of TFIIE and TFIIH into the preinitiation complex TFIIF and members of the ELL and Elongin families, can interact directly with elongating polymerase and increase its elongation rate by suppressing transient pausing by the enzyme at all or most steps of nucleotide addition Helping to maintain the 3-OH terminus of the nascent transcript in proper alignment with the polymerase catalytic site, thereby preventing backtracking by the enzyme.

40 CTD is essential for the function of RNA polymerase IIdeletions that remove only a fraction of the heptapeptide repeats can be lethal phosphorylation of the CTD in elongation by RNA polymerase II the CTDs of actively elongating polymerases are highly phosphorylated polymerases containing hypophosphorylated CTDs preferentially enter the preinitiation complex, where they are subsequently phosphorylated during or shortly after initiation

41 ELONGATOR AND FACT PROMOTE RNA POLYMERASE II ELONGATION THROUGH CHROMATINElongator and FACT appear to promote RNA polymerase II elongation by modifying nucleosomes in ways that facilitate passage of polymerase through chromatin. Elongator is highly conserved from yeast to man. Notable among the Elongator subunits are Elp3, a histone acetyltransferase (HAT) of the GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) family, Mechanistic studies suggest that FACT stimulates RNA polymerase II elongation through nucleosomes by binding them and promoting removal of nucleosomal histones H2A and H2B

42 THE RNA POLYMERASE II ELONGATION COMPLEX FUNCTIONS AS A PLATFORM THAT COORDINATES mRNA PROCESSING AND EXPORT

43 Formación del transcripto primario y su procesamiento durante la maduración del mRNA en células eucarióticas

44 Capping Capping of RNA polymerase II transcripts occurs when they reach a length of 25 to 30 nucleotides and requires the concerted action of three enzymes: an RNA triphosphatase, which removes the -phosphate at the 5-end of the nascent transcript; a guanylyltransferase, which transfers a GMP cap to the resulting diphosphate terminus of the nascent transcript; and a methyltransferase, which adds a methyl group to the N7 position of the GMP cap to form the transcript’s mature m7G(5)ppp(5)N cap structure. mammalian and yeast guanylyltransferase are recruited to transcribing RNA polymerase II through specific interactions with the phosphorylated CTD CTD phosphorylation by the TFIIH CTD kinase may provide a signal that links capping to the synthesis of nascent transcripts

45 5’CAP

46 Polyadenylation CPSF: cleavage and polyadenylation specificity factor CstF: cleavage stimulation factor the RNA polymerase CTD is required for efficient 3´ cleavage of transcripts prior to poly(A) addition by poly(A) polymerase

47 Los intrones pueden ser removidos por mecanismos diferentesTipo I Tipo III Tipo II

48 splicing It is likely that the CTD recruits components of the splicing machinery to the RNA polymerase II elongation complex. SR and snRNP proteins have been shown to interact with phosphorylated RNA polymerase II and phosphorylated CTD peptides. The CTD could stimulate splicing at least in part by promoting assembly of early splicing intermediates, such as the U1 snRNP-5 splice site complex or the U2 snRNP-branch site complex

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50 pol I rRNA ribosoma RNApol II DNA proteína mRNA pol III tRNA

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54 Los rRNA y tRNA se generan a partir de un transcripto primario comúnE.coli Eucariotas Síntesis de tRNA

55 En el nucleolo se producen las subunidades ribosomalesEl nucleolo contiene grandes bucles de ADN que emanan de diferentes cromosomas, cada uno de los cuales contiene un conjunto de genes de rRNA Ese conglomerado de genes forman la región organizadora nucleolar (NO). Esta región se encuentra rodeada por un anillo de material electrón-denso denominado pars fibrosa (PF) que está constituido por rRNA recientemente transcrito Por fuera de esta región se encuentra la denominada pars granulosa (PG) que son las ribonucleoproteínas constituyentes de los ribosomas. El nucleolo incrementa su tamaño cuando la célula es estimulada en la producción de proteínas. El nucleolo desaparece durante la división celular y se forma nuevamente a partir de la región organizadora nucleolar.