1 INTERACCIONES MOLECULARES Y ESTRUCTURAS FUNCIONALES EN LAS MEMBRANAS

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3 INTERACCIONES ENTRE COMPONENTESlípido - lípido proteína - proteína proteína - lípido

4 INTERACCIONES ENTRE ESTRUCTURAScitoesqueleto matriz extracelular efectores celulares

5 LA MEMBRANA COMO CRISTAL LIQUIDO

6 Las membranas son estructuras supramoleculares formadas por interacciones débilesEstas interacciones no son lo suficientemente fuertes como para inmovilizar las moléculas que componen las membranas Por ello las membranas se comportan como un líquido a temperaturas fisiológicas Sin embargo, muestran a la vez un orden cristalino en su estructura

7 gas líquido cristal sólido líquidoEl estado de cristal líquido es un estado intermedio entre el estado líquido y el sólido: gas líquido cristal sólido líquido +calor calor calor -calor calor calor no todas las moléculas tienen la capacidad de llegar a un estado de cristal líquido

8 forma de la molécula: elongadatamaño de la molécula: peso molecular mínimo: 200 4 - 8 1

9 Pueden haber dos tipos de estado de cristal líquido:termotrópico (sistema de 1 componente) liotrópico (sistema de 2 o más componentes) Membranas: estado liotrópico de 2 componentes - agua:moléculas anfipáticas El estado liotrópico puede tener 4 sub-estados: lamelar cúbico hexagonal micelar Estos subestados dependen de la cantidad de agua presente en el sistema H2O

10 cúbica lamelar micelar hexagonal

11 Las membranas biológicas son micelas discoidales cerradas sobre sí mismas

12 muchos diacilglicerofosfolípidos saturadosFORMA TRIDIMENSIONAL DE LAS MOLECULAS ANFIPATICAS insaturaciones muchos diacilglicerofosfolípidos saturados ac. lisofosfatidico fosfatidiletanolamina

13 micela invertida micela bicapa

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15 MOVILIDAD DE LOS COMPONENTES DE LAS MEMBRANAS

16 PROTEINAS

17 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)

18 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)

19 LIPIDOS

20 Tasa de movimiento espontáneo a través de la bicapa y difusión a la fase acuosaA. Cabeza polar grande o polar o región hidrofóbica pequeña: dificultad para movimiento transbicapa facilidad para salir de la bicapa B. Cola hidrofóbica larga: movimiento transbicapa fácil tendencia a salir de la bicapa disminuye A + B: disminución de ambas tasas (ej. gangliósidos).

21 PROTEINAS: retardo de la movilización

22 UNION ESTRECHA (tight junction)

23 UNION DE HENDIDURA (gap junction)

24 LIPIDOS: retardo de movilizaciónBALSAS LIPIDICAS

25 LIPIDOS: retardo de movilizaciónBALSAS LIPIDICAS

26 FLUIDEZ DE LA MEMBRANA

27 Las moléculas anfipáticas en las membranas se encuentran en estado fluído

28 La interacción entre lípidos y proteínas determina un estado de “mosaico fluído”

29 REGULACION DE LA FLUIDEZ DE LA MEMBRANA:propiedades fisicoquímicas de los lípidos interacción entre lípidos y proteínas

30 Propiedades fisicoquímicas de los lípidos:Temperatura de transición de fase de los fosfolípidos Modificación de la temperatura de transición de fase de los fosfolípidos por acción del colesterol, cationes divalentes y pH

31 Temperatura de transición de fase de los fosfolípidos

32 Conformación todo trans Conformación todo gaucheMáximo número de interacciones de Van der Waals Máximo orden del solvente alrededor de las cabezas polares Ruptura de interacciones de Van der Waals Ruptura del orden del solvente alrededor de las cabezas polares

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35 El tipo de cabeza polar y la estructura de los ácidos grasos modifican el Tm y el rango de temperaturas de la transición de fase de los fosfolípidos

36 Movilidad de las cadenas hidrocarbonadas ácidos grasos saturados: máxima capacidad de movimiento (todo gauche) la capacidad de movimiento se hace mayor en los carbonos cercanos al extremo metílico desde C1 hasta C9 el movimiento es moderado y parejo de C10 en adelante el movimiento se hace cada vez mayor a medida que se acerca al extremo metílico ácidos grasos insaturados: capacidad de movimiento restringida

37 Características de los ácidos grasos que afectan la Tm longitud de la cadena hidrocarbonada posición relativa de cadenas de diferente longitud en el fosfolípido número de dobles enlaces en una cadena hidrocarbonada posición de los dobles enlaces en la cadena hidrocarbonada número de cadenas insaturadas en un mismo fosfolípido

38 Características de los fosfolípidos que afectan la Tmcarga de la cabeza polar: repulsión tamaño de la cabeza polar: impedimento estérico Factores que modifican las características de los fosfolípidos que afectan la Tm presencia de cationes divalentes: neutralizan lípidos negativos pH: modifica el grado de ionización de las cabezas polares

39 Influencia del colesterol sobre la Tmcolesterol: aproximadamente 19Å de longitud, 25Å de área seccional en la zona de los anillos

40 Influencia del colesterol sobre la Tmel colesterol reduce el movimiento de las cadenas hidrocarbonadas en bicapas fluidas, disminuyendo la fluidez (“efecto de condensación”) estaría mediado por el volumen de los anillos de la molécula y por interacciones de Van der Waals de la cola hidrocarbonada del colesterol con los ácidos grasos vecinos una molécula de colesterol interactuaría con 7 cadenas hidrocarbonadas la interacción es mayor con los 9 primeros carbonos saturados de la cadena en bicapas sólidas, interfiere con el empacamiento “todo trans”, aumentando la fluidez estaría mediado por el volumen de los anillos de la molécula

41 Ejemplos de temperatura de transición de fase en fosfolípidos

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47 Interacción entre lípidos

48 El colesterol incrementa el largo de las colas hidrocarbonadas de PC pero no de SMSM forma bicapas con un ancho de 46–47 Å ( SM C18:0) a 52–56 Å (SM C24:0) El ancho de una bicapa de PC C16:0/C18:1 es 35 Å, y es expandida a 40 Å con colesterol El andho del centro hidrofóbico de la bicapa es incrementado de 26 to 30 Å Dependiendo si los dominios en ambas superficies colocalizan, podrían formarse hasta 4 anchos diferentes en la bicapa

49 Interacción entre lípidos y proteínas

50 Los lípidos se agruparían formando un anillo alrededor de las proteínas

51 Cada proteína tiene preferencia por cabezas polares específicas para su máxima actividad

52 La actividad de las proteínas integrales de membrana varía dependiendo del estado físico de los lípidos

53 Las proteínas pueden tener distintos tipos de interacción con los lípidos dependiendo de la relación lípido/proteína de la membrana y del estado físico de los lípidos

54 Cambios en las cargas de las cabezas polares por efecto del pH o presencia de iones puede alterar la interacción de los lípidos con las proteínas de membrana

55 MATCHING HIDROFOBICO Cuando la longitud transmembrana de la proteína no es igual a la longitud transmembrana de los lípidos, se crea un “mismatch”

56 Ilustración de interacciones proteína–proteína inducidas por “mismatch” hidrofóbico(a) Membrana con ”match” (b,c) Casos de “mismatch” hidrofóbico en el mismo sentido, lleva a atracción de proteínas mediada por lípidos. (d) Caso de “mismatch” de sentido opuesto, lleva a repulsión de proteínas mediada por lípidos.

57 MECANISMOS DE ASOCIACION DE PROTEINAS EN LA MEMBRANAacumulación en microdominios lipídicos distintos interacción específica proteína-proteína La membrana contiene microdominios con composición de lípidos diferente. Estos microdominios contienen diferentes grupos de proteínas El mecanismo para la acumulación selectiva de proteínas en un ambiente lipídico se puede explicar por una preferencia de las proteínas por las propiedades químicas (hidrofobicidad) o físicas (grosor de la bicapa, microviscosidad) del microdominio lipídico. Las asociaciones de proteínas en el orden de nanómetros se consideran interacciones mediadas por lípidos. También existe asociación de proteínas dada por interacciones específicas proteína–proteína mediadas por proteínas transmembrana o unión de ligandos.

58 Ejemplos de interacción entre lípidos y proteínas: SISTEMAS DE SEÑALIZACION

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60 MECANISMOS DE COMPARTAMENTALIZACION DE LA SEÑALIZACION EN BALSAS LIPIDICAS(A) El receptor puede ser residente constitutivo de la balsa lipídica (B) El receptor podria residir fuera de la balsa lipídica, pero translocarse luego de la unión al ligando

61 MECANISMOS DE COMPARTAMENTALIZACION DE LA SEÑALIZACION EN BALSAS LIPIDICAS(C) (1) La unión de un ligando a un receptor localizado en una balsa lipídica puede iniciar una señal compartamentalizada en el interior de la balsa (2) esta señal es inactivada cuando el complejo ligando receptor se transloca fuera de la balsa (3) otra posibilidad es que el receptor se transloque fuera de la balsa lipídica, permitiendo su asociación con proteínas de la cascada de señalización que se encuentran fuera de la balsa lipídica También podría suceder lo mismo mas bien con los efectores. (D) El receptor esta localizado fuera de la balsa pero al activarse comunicaría una señal hacia la balsa lipídica, que iniciaría una señal compartamentalizada

62 BALSAS LIPIDICAS: ESPEIFICIDAD EN LA SEÑALIZACION Y FORMACION DE COMPLEJOS DE SEÑALIZACION(A) Subpoblaciones distintas de balsas lipídicas con composición de lípidos y proteínas unicas, y funciones especializadas estarían presentes en la superficie de una misma célula. Balsas lipídicas diferentes estarían involucradas en la compartamentalización de diferentes vías de señalización. (B) La agregación de balsas en respuesta a ciertos estímulos puede crear rápidamente complejos de señalización que pueden amplificar señales o incrementar la comunicación cruzada entre vías de señalización relacionadas. La interacción con el citoesqueleto estaría involucrada con la regulación del agregamiento de las balsas, y también con la asociación de proteínas individuales con las balsas. Las balsas que se agregan podrían tener diferente constitución Esta agregación sería un mecanismo para permitir la regulación espacial de la transducción de señales

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64 Ejemplos de interacción entre lípidos y proteínas:TRAFICO VESICULAR Y SEGREGACION DE COMPONENTES EN EL ENSAMBLAJE DE LAS MEMBRANAS BIOLOGICAS

65 biosíntesis de los lípidos de membrana biosíntesis de las proteínas de membrana RE Golgi ensamblaje de las membranas ordenamiento y segregación de lípidos y proteínas (“sorting”) orientación (topogénesis) de las proteínas en la membrana

66 segregación de lípidos y proteínas desde el RE hacia Golgi, la membrana plasmática y los lisosomasreciclamiento de componentes de membrana en la vía endocítica distribución diferencial de lípidos entre monocapas

67 Las membranas mantienen asimetría en sus monocapasmínima en el RE máxima en la membrana plasmática

68 La célula utiliza las propiedades estructurales y la capacidad de señalización celular de los lípidos para controlar el transporte de membranas. La interacción lípido-proteína es muy importante en este proceso El transporte selectivo de proteínas a localizaciones celulares específicas y el transporte de lípidos han evolucionado de manera coordinada

69 Actividad de lípidos en la céluladeterminada por su concentración local en el tiempo balance entre síntesis e hidrólisis transporte

70 Segregación de lípidos y proteínas desde el RE hacia Golgi, la membrana plasmática y los lisosomas

71 Células epiteliales polarizadasmembrana apical: abundancia de glicoesfingolípidos y/o esfingomielina membrana basolateral: similar a membrana plasmática de células no polarizadas las mayores diferencias están en la monocapa externa, donde la difusión está bloqueada por la presencia de uniones estrechas (tight junctions)

72 La composición lipídica de endosomas y lisosomas es similar a la de la membrana plasmática, sólo que contienen gran cantidad de ácido liso-bisfosfatídico (LBPA) Los peroxisomas y la mitocondria tienen composición de lípidos semejante al RE, pero la membrana interna es rica en cardiolipina.

73 EJEMPLOS DE DIRECCIONAMIENTO DE LIPIDOSFosfolípidos, colesterol: ER --> mitocondria --> peroxisoma Glucosilceramida: golgi PS, PE: hacia la monocapa citosólica de la membrana plasmática fosfolípidos saturados + colesterol: ER, golgi -> membrana plasmática fosfolípidos insaturados: membrana plasmática -> ER, golgi en células polarizadas: glicoesfingolípidos + esfingomielina -> membrana apical

74 trans medial cis

75 Mecanismos de transporte de lípidos a través y entre membranas celularesa) difusión lateral en la membrana b) translocación entre las 2 monocapas c) difusión al citosol y equilibrio con la superficie citosólica de otra organela d) difusión al citosol y equilibrio con la superficie citosólica de otra organela, en sitios de contacto entre membranas e) mediante la formación de vesículas: la disposición transmembrana se mantiene durante la fisión y fusión

76 transporte de monómerosacceptor membrane donor membrane

77 El transporte unidireccional de un lípido se da cuando el flujo neto (diferencia en el transporte hacia delante y hacia atrás) presenta una dirección. Para mantener diferencias en la distribución de lípidos entre organelas, el transporte inespecífico (ej. movimiento de monómeros a través de su gradiente de concentración) debe ser balanceado por un transporte específico por otro mecanismo (ej. movimiento unidireccional de vesículas)

78 Mecanismos moleculares involucrados en la segregación de lípidos

79 TRANSLOCADORES INDEPENDIENTES DE ENERGIAflipasa: RE transporte bidireccional no sería específica transportaría PC y PE también translocaría fosfoglicerolípidos de dolicol y glicosilfosfatidilinositoles desde la monocapa citosólica hacia la lumenal del RE translocador de glicosilceramida: Golgi de monocapa citosólica hacia el lumen translocador de ácidos grasos: membrana plasmática paso de ácidos grasos hacia el citosol scramblasa: bidireccional se activaría en apoptosis transporte bidireccional PS, SM

80 TRANSLOCADORES INDEPENDIENTES DE ENERGIAtrabajan moviendo lípidos a favor de la gradiente de concentración equilibran distribución de lípidos a través de la bicapa podría darse un movimiento neto en una dirección, si: se mantiene la síntesis continua del lípido existe un sumidero para el lípido a un lado de la membrana

81 TRANSLOCADORES DEPENDIENTES DE ENERGIAutilizan ATP la mayoría en membrana plasmática crean asimetría en la membrana translocasa de aminofosfolípidos PS, PE hacia la monocapa citosólica transportadores ATP Binding Cassette (ABC) ABCB4 (Mdr2): PC hacia la monocapa extracelular ABCB1 (Mdr1): PAF, glucosilceramida (también en Golgi) ABCA1: salida de colesterol hacia HDL translocación de la monocapa interna a la externa podría translocar indirectamente el colesterol, junto con PS mediado por Ca++?

82 PROTEINAS TRANSLOCADORAS DE MONOMEROSen el citosol actuarían poniendo en contacto las membranas podrían actuar como acarreadores actividades de transporte descritas: PC PI / PC PI / SM glicolípidos en la mitocondria STAR (STeroidgenic Acute Regulatory protein) transporte de colesterol desde la membrana mitocondrial externa a la interna

83 Transportadores ABC pueden combinar translocación con extrusión pueden unirse a un sustrato anfipático en una monocapa e hidrolizar ATP para extruír la molécula en la fase acuosa del lado opuesto de la membrana} la extrusión se realiza mediante la translocación de estos lípidos hacia micelas de ácidos biliares o HDL de otra forma, este proceso no sería termodinámicamente posible para el caso de fosfolípidos, esfingolípidos o colesterol, ya que el cambio de energía libre entre el monómero en medio acuoso y la forma de membrana (ej. 70 kJ mol-1 para PC) es mucho mayor que la energía liberada a partir del ATP (30 kJ mol-1)3 alternativamente pueden mover los lípidos a la monocapa opuesta (translocación)

84 SEGREGACION DE LIPIDOS DURANTE EL TRANSPORTE VESICULAResfingolípidos: sintetizados en Golgi deben ser segregados hacia el transporte anterógrado (membrana plasmática), y no el retrógrado (RE) la segregación se daría por su capacidad de formar puentes de hidrógeno entre si

85 SEGREGACION DE LIPIDOS DURANTE EL TRANSPORTE VESICULARcolesterol: se segregaría hacia la membrana plasmática por su afinidad con los esfingolípidos en una mezcla de esfingolípidos y glicerofosfolípidos, el colesterol puede inducir inmiscibilidad, resultando en la separación lateral de 2 o más fases el colesterol interactuaría también con PS disaturada

86 BALSAS DE ESFINGOLIPIDOS Y COLESTEROLdominio de esfingolípidos y colesterol (naranja) rodeado de PC insaturada (azul) estas balsas posiblemente complementan con otras balsas de fosfatidilserina/colesterol (amarillo) en un ambiente de PE (verde) Dominio: 700 lípidos en cada monocapa. Grosor máximo 50 Å, grosor mínimo 40 Å.

87 Mecanismos moleculares involucrados en la segregación de proteínas

88 DOMINIOS DE ESFINGOLIPIDOSlas proteínas serían segregadas desde Golgi hacia la membrana plasmática por la longitud de sus segmentos transmembrana es posible que el grosor de la membrana se vaya haciendo cada vez mayor desde el Golgi hacia la membrana plasmática dominios colesterol-esfingolípidos segregarían proteínas lipidadas GPI proteínas miristoiladas y palmitoiladas (no preniladas)

89 El colesterol incrementa el largo de las colas hidrocarbonadas de PC pero no de SMSM forma bicapas con un ancho de 46–47 Å ( SM C18:0) a 52–56 Å (SM C24:0) El ancho de una bicapa de PC C16:0/C18:1 es 35 Å, y es expandida a 40 Å con colesterol El ancho del centro hidrofóbico de la bicapa es incrementado de 26 a 30 Å Dependiendo si los dominios en ambas superficies colocalizan, podrían formarse hasta 4 anchos diferentes en la bicapa

90 Segregación lateral de proteínas de membranaLas proteínas pueden ser segregadas mediante marcas en sus colas citosolicas que les permitan interactuar con proteínas cubierta, dirigiendo la vesícula hacia una organela blanco. La interacción puede ser directa como en el caso de las cubiertas COP o indirecta, a través de proteínas adaptadoras (APs), como en el caso de la cubierta de clatrina. Las proteínas pueden ser también segregadas de acuerdo a la longitud de su dominio transmembrana la incorporación de dominios lipídicos de un cierto ancho en distintos transportadores estaría determinada por las propiedades físicas de la membrana o por señales de direccionamiento que estarían presentes en cada dominio.

91 Segregación lateral de proteínas de membranaLas proteínas ancladas a lípidos son segregadas gracias a las propiedades de partición del ancla lipídica: Las proteínas ancladas por un glicosilfosfatidilinositol (GPI) son segregadas hacia dominios líquido-ordenados. La miristoilación (C14:0) o palmitoilación (C16:0) de proteínas es una señal de incorporación en la misma parte de la membrana que contiene esfingolípidos y colesterol, indicando que la superficie citosólica de esos dominios debería también tener una composición lipídica especial. Las proteínas preniladas, ancladas por grupos farnesil o geranilgeranil son excludias de los dominios esfingolípidos–colesterol. Las proteínas también pueden ser segregadas a través de la unión a otras proteínas de membrana la oligomerización puede ser un determinante físico para la localización de proteínas en el golgi.

92 Curvatura de membranas: fusión y fisiónLos lípidos dan la flexibilidad necesaria en la membrana para los procesos de fisión y fusión de vesículas

93 Curvatura de membranas: fusión y fisiónLa forma de un lípido de membrana depende del tamaño relativo de su cabeza polar y de sus colas hidrofóbicas. En casos en los cuales la cabeza polar y las colas hidrocarbonadas tienen la misma área transversal, la molécula tiene una forma cilíndrica (PC; PS) Los lípidos con una cabeza polar pequeña como PE tienen forma de cono Cuando la región hidrofóbica ocupa un área pequeña, la molécula tiene forma de cono invertido LPC y en cierto grado SM Este “polimorfismo lipídico” podría tener participación en generación de curvaturas en la membrana durante la fisión y fusión de vesículas

94 Curvatura de membranas: fusión y fisiónMonocapa citosólica de la membrana plasmática: 40% fosfatidiletanolamina 60% fosfatidilserina +fosfatidilcolina Monocapa lumenal: 60% fosfatidilcholina 30% esfingomielina 10% fosfatidiletanolamina. PE por si misma adopta una fase hexagonal, y esta tendencia probablemente favorece la invaginación de la membrana. La gemación en la dirección opuesta, hacia el lumen de los endosomas podría requerir LPA (cono invertido) en la superficie lumenal, y fosfatidilinositol 3 fosfato El colesterol es necesario para la gemación de las vesículas sinápticas, altamente curvadas (40–50 nm diámetro). El colesterol y SM son también importantes para estabilizar las membranas durante la fusión. PE estimula eficiencia de fusión.

95 Fosfoinosítidos en fusión y fisión de vesículasCitoesqueleto: mantiene forma de la célula, participa en la motilidad filamentos de actina filamentos intermedios microtúbulos Debe interactuar activamente con la membrana: anclarse reversiblemente a la bicapa interacción regulada por procesos de señalización interacción con proteínas interacción con lípidos Lípidos negativos interactúan con secuencias de aminoácidos positivos en estas proteínas, o secuencias hidrofóbicas se insertan en la bicapa lipídica Recién se está estudiando la vinculación de la unión de los lípidos

96 Overview over lipid-binding sites In cytoskeletal proteins a Protein Lipid specificity Binding-site features Spectrin PtdIns(4,5) P 2 , PtdIns(3,4,5) P 3 , PtdIns(3,4) P 2 Pleckstrin-homology domain Dynamin PtdIns(4,5) P 2 , PtdIns(3,4,5) P 3 , PtdIns(3,4) P 2 Pleckstrin-homology domain Myosin X PtdIns(3,4) P 2 PtdIns(3,4,5) P 3 Pleckstrin-homology domain 21 Ezrin, radixin PtdIns(4,5) P Clusters of surface-exposed Lys residues cooperating in binding Gelsolin PtdIns(4,5) P 2 , PtdIns(3,4,5) P 2 , PtdIns(3,4) P 2 Three different cooperating sites rich in basic residues Actophorin Polyphosphoinositides a helix with clusters of Lys residues Cortexillin I PtdIns(4,5) P C-terminal gelsolin-like basic motif Profilin PtdIns(3,4) P 2 > PtdIns(4,5) P 2 Conserved pocket created by the N-terminal hydrophobic helix and a basic C-terminal region N-WASP PtdIns(4,5) P Site rich in basic residues 49 Vinculin Acidic phospholipids, PtdIns(4,5) P 2 , Hydrophobic hairpin and a five-helix PtdIns(3,4,5) P bundle MARCKS Polyphosphoinositides, acidic phospholipids N-terminal myristate and 13 basic residues Annexin family Acidic phosphoplipids, phosphatidylserine Ca 2+ -mediated interaction via endonexin-fold and, at pH 5, formation of a transmembrane pore a Abbreviations: MARCKS, myristoylated alanine-rich C kinase substrate; N-WASP, neural Wiscott–Aldrich-syndrome protein; PtdIns(4,5) P 2 ,phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; PtdIns(3,4) P 2 , phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate; PtdIns(3,4,5) P 3 , phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphate.. TRENDS in Biochemical Sciences Vol.26 No.10 October 2001