1 Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

2 Andrew Fire i Craig C. MelloNobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello

3 RNAi historia 1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello) pierwsze wskazówki jednak już w latach 1990: próba wprowadzenia dodatkowego genu syntazy chalonowej daje efekt odwrotny – poziom mRNA dla syntazy spada Konserwatywny mechanizm w świecie zwierząt i roślin spełniający funkcje: Obrona przed infekcjami wirusowymi Obrona przed transpozonami Regulacja metylacji DNA w obrębie promotora Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133

4 Wprowadzenie do tytoniu dwóch osobnych transgenów wykorzystujących taki sam promotorx CH3 Pierwszy transgen jest aktywny o ile nie jest w komórce obecny drugi transgen → metylacja DNA promotora wyciszanego transgenu w obecności drugiego zawierającego sekw. homologiczne Wyciszenie i metylacja zanikają w kolejnych komórkach potomnych na skutek odseparowania dwóch transgenów Interakcja wspólnych promotorów indukuje transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów -TGS (transcriptional gene silencing)

5 siRNA (ang. short interfering RNA) – krótka dwuniciowa cząsteczka RNA (21-23 nt) o sekwencji homologicznej do fragmentu docelowego mRNA

6 DICER końce 3’ mają 2nt niesparowane Uwaga: wprowadzanie dsRNA do komórek kręgowców indukuje odpowiedź interferonową

7 DICER – enzym typu RNAza IIIZawiera domeny: Domena o właściwościach helikazy i hydrolazy fosfodwuestrowej; RBD (RNA Binding domain) – wiążąca RNA dsRBD (dsRNA Binding domain) – wiążąca dsRNA PAZ (Piwi, Argonaute, Zwille/Pinhead); działa w postaci dimerycznej → produkty działania enzymu DICER mają niesparowane 2 nukleotydy na końcu 3’ i grupę fosforanową na końcu 5’ (inne produkty słabiej indukują interferencję)

8 RISC (RNA-induced silencing complex) jest złożony:1. Białka z rodziny Argonaute posiadają 3 domeny: PAZ – wiązanie końca 3’ siRNA Mid - wiązanie końca 5’ siRNA PIWI – aktywność endonukleazy (pokrewna RNAzy H) Ago1 – odpowiedzialny za represję, Ago2 – za właściwości endonukleazy do kompleksu RISC wchodzą jeszcze inne białka o nieznanej dotąd funkcji (VIG, Tudor-SN, Fragile-X, Dmp68, Gemin3) RISC jest częścią struktury cytoplazmatycznej zwanej ciałkami P (P-bodies)

9 Degradacja mRNA przez kompleks RISC:w kompleksie RISC dochodzi do degradacji nici sensownej, pozostaje antysensowna (wiodąca); wybór nici jest uzależniony od stabilności termodynamicznej końców siRNA – nić posiadająca mniejszą stabilność na końcu 5’ pozostaje w RISC (etap katalizowany przez DICER) w rejonie „seed” zlokalizowanym pomiędzy 2 i 8 nukleotydem od końca 5’ następuje rozpoznanie i wiązanie z docelowym mRNA antysensowna nić hybrydyzuje z komplementarnym mRNA tworząc krótki fragment dwuniciowy przecięcie mRNA w pojedynczym miejscu oddalonym pomiędzy 11-12nt od końca 3’ siRNA (Ago2) dalsza degradacja mRNA przez niespecyficzne egzonukleazy mRNA siRNA

10 w przypadku niepełnej komplementarności sekwencji siRNA do mRNA zachodzi inhibicja translacjiMechanizmy odpowiedzialne za ogólną degradację mRNA: przed degradacją zachodzi proces deadenylacji końca 3’ poli(A), po której następuje działanie egzonukleolityczne 3’ – 5’ przez egzosom dekapowanie przez Dcp1/Dcp2, po którym degradacja przy udziale egzonukleaz 5’ - 3’

11 Zjawisko przechodzącego wyciszania (transitive silencing)GFP siRNA białko fuzyjne UNC-22 i GFP przejście wyciszenia w kierunku od 3’ do 5’ wyciszenie UNC-22 i GFP wyciszenie GFP Gregory J. Hannon RNA interference, Nature (2002) 418,

12 Mechanizm przechodzącego wyciszaniapierwotne siRNA polimeraza RNA zależna od RNA RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) dsRNA wtórne siRNA Brodersen and Voinnet The diversity of RNA silencing pathways in plants TRENDS in Genetics (2006) 22,

13 Metody wytwarzania siRNA: synteza chemiczna (siRNA) transkrypcja in vitro (esiRNA) wektory ekspresyjne siRNA (shRNA jako pośredni etap) ekspresyjne kasety PCR Kryteria projektowania cząsteczek siRNA: Znajdź sekwencję 21nt która zaczyna się od AA (siRNA posiadające jednoniciowe odcinki UU działają najefektywniej); jeśli się nie da – należy wybrać sekwencję NA lub inną ale unikać jednoniciowych odcinków GG w siRNA Zaprojektuj 2-4 sekwencje w różnych rejonach ale nt poniżej AUG (w obrębie 5’ UTR lub 3’ UTR mRNA może być związane z białkami oraz posiadać złożoną strukturę) – jedna na dwie daje 50% hamowanie a jedna na cztery – 75-95% zawartość GC – 30-70% (optymalnie 50%) unikać ciągu (G)3 gdyż mogą się tworzyć agregaty cząsteczek siRNA koniec 5’ nici antysensownej ma mieć mniejszą stabliność termodynamiczną Sprawdź komplementarność do innych genów