1 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004LIPÓLISIS Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela Agosto 2004 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

2 Hidrólisis enzimática de la materia grasa que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos lácteos. Sustrato Glóbulo de Grasa Lipasas Enzima INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

3 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004¿QUÉ SON LAS LIPASAS? L I P O T C F L A V O R INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

4 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004CLASIFICACIÓN Naturales: propias de la leche Leucocitarias: secretadas por las células somáticas Microbianas: secretadas por la flora psicrótrofa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

5 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004LIPASAS NATURALES: Secretadas por las glándulas mamarias Son termolábiles pH óptimo entre 8 y 9 Se inhiben en condiciones a altas concentraciones de: sales, AGL y proteínas Atacan preferentemente las posiciones extremas del glicerol → AGLs producidos son ricos en AGs de cadena corta INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

6 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004LIPASAS MICROBIANAS Provienen esencialmente de bacterias psicrótrofas (principalmente P. Fluorescens) Su producción se ve favorecida por la presencia de caseínas y proteínas del lactosuero pH óptimo entre 8 y 9, 50% de activiadad al pH de la leche Temperaturas óptimas de acción entre 30 y 40ºC Atacan preferentemente los triglicéridos homogéneos, con AG de cadena corta o insaturadas INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

7 Triglicéridos protegidos por unaSUSTRATO Glóbulo de Grasa ↓ Triglicéridos protegidos por una “membrana” INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

8 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004TIPOS DE LIPÓLISIS 1) LIPÓLISIS INDUCIDA Cuando la leche cruda se somete a tratamientos físicos o químicos que rompen la membrana del glóbulo de grasa y facilitan el acceso de la lipasa a los triglicéridos. Este tipo de tratamientos se denominan de “Tratamientos de activación” y se producen durante y después del ordeñe. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

9 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004a) Tratamientos de Activación: Agitación y formación de espuma Cambios de temperatura Homogenización Procesos de congelación y derretimiento INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

10 b) ¿Cómo afecta la temperatura a estos tratamientos?Durante la activación: a menor temperatura más resistencia a la activación  mantener la leche refrigerada Durante el almacenamiento: una vez activada mantener la leche a bajas temperaturas. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

11 c) Problemas en el tamboOrdeñadoras:diseños inadecuados y poco mantenimiento Entrada de aire en pezoneras Juntas que pierden Agujeros y rajaduras en tubos de goma Bajos caudales de leche Favorecen entrada de aire → lipólisis INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

12 c) Problemas en el tamboCañerías : mayor activación a mayor longitud y número de juntas Tanque de enfriamiento : formación de espuma, caída de la leche al tanque ⇒ baja activación Bombeo: Utilización de bombas centrífugas debajo de su capacidad y admisión de aire a través de juntas defectuosa ⇒alta activación INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

13 c) Problemas en el tamboAlmacenamiento la cantidad de lipólisis aumenta con el tiempo y la temperatura de almacenamiento La velocidad a la cual ocurre la lipólisis va disminuyendo pero no se frena completamente hasta la inactivación de la lipasa ( pasteurización ). A mayor tiempo de almacenamiento mayor es la posibilidad del crecimiento bacteriano que también contribuye significativamente a la lipólisis INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

14 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004d) Problemas en el transporte - no es determinante y está asociada al pasaje de la leche por las bomba - debe ser refrigerado INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

15 e) Problemas en fábricaExcesivo bombeo → alta agitación y mezcla con aire Desnatado → activación por cambios de T ↳ daño mecánico Mezcla de leche cruda con leche homogenizada Refrigeración deficiente Largos tiempos de almacenaje INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

16 2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEATIPOS DE LIPÓLISIS 2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA cuando la leche presenta lipólisis en forma natural sin ningún tipo de activación Se las denomina “leches naturalmente activas”, “leches susceptibles” o “leches espontáneas” Leches “normales” son las que no presentan lipólisis espontánea Porcentaje de vacas en un tambo que producen leche espontánea se estima entre 3 y 35% INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

17 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004a) Características de leche espontánea: Efecto de enfriamiento Enfriamiento a T < 15 ºC inmediatamente después del ordeñe mayor grado de lipólisis Mezcla con leches normales La leche espontánea disminuye su actividad lipolítica Susceptibilidad a la lipólisis inducida Es más susceptible a los distintos tipos de activación, probablemente debido a membranas más débiles Factores bioquímicos Membranas más débiles Cantidad de lipasa Escasa presencia de inhibidores ( presentes en leches normales ) Presencia de activadores de lipasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

18 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Alimentación y estado nutritivo Estado de lactancia Estación del año b) Factores relacionados a la vaca Raza Mástitis Producción de leche y de grasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

19 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004TIPOS DE LIPÓLISIS 3) LIPÓLISIS MICROBIANA Producida principalmente por bacterias psicrótrofas, cuya característica es crecer a bajas temperaturas ( ej. Pseudomonas ) Las lipasas microbianas pueden atacar al glóbulo de grasa intacto Muchas de ellas son termorresitentes, no se inactivan por procesos de pasteurización y pasan a los productos lácteos donde producen rancidez INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

20 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004LIPÓLISIS EN PRODUTOS LÁCTEOS INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

21 ¿ Por qué nos interesa estudiar la lipólisis ?La lipólisis produce ácidos grasos libres , que junto a otros compuestos, son los responsables del aroma y sabor de la leche y productos lácteos Según la naturaleza y la cantidad de estos AGLs se producen defectos del flavor. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

22 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Contribución de los sitemas enzimáticos a la lipólisis de los productos lácteos AGL en productos lácteos Lipólisis pre-manufactura: AGL provinientes de la leche Inducida – Espontánea Lipólisis post-manufactura: AGL desarrollados en los productos. Crecimiento microbiano. Pobre Higiene. Actividad de enzimas termorresitentes INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

23 responsables del flavor lipolíticoDefectos del flavor: C4 – C12 responsables del flavor lipolítico C10 y C12 Sabor jabonoso C4 al C8 Sabor rancio INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

24 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Ácidos Grasos Libres: Ácidos débiles que se distribuyen en la leche y en los productos lácteos según su solubilidad y la cantidad de agua del producto. En los procesos tecnológicos: los AGL de cadena corta siguen la fase acuosa Los de cadena larga se van con la grasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

25 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

26 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Leche comercial - la lipólisis no parece ser un tema importante - Aparece sabor rancio en valores de BDI > 1.5 - A bajos niveles la rancidez hidrolítica en estos productos se aprecia organolépticamente como sabor a viejo, sucio o sabor a vaca. - A altos valores los defectos se perciben como sabor a cabra, amargo, butírico y rancio - Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

27 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Crema y Manteca - la crema presenta valores de BDI mayores a los de la leche. - si la leche utilizada en la producción es rancia, los AGL responsables de la rancidez se van parcialmente con el agua. - generalmente la lipólisis desarrollada es post-manufactura - La sal inhibe la acción de las lipasas - Los defectos se perciben como sabor a sucio, amargo, rancioy aceitoso - Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

28 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Quesos - Los AGL contribuyen en gran parte al flavor característico de muchos tipos de quesos. - El grado de “aceptación” de esa lipólisis depende del tipo de quesos -Generalmente presentan lipólisis de post-manufactura debido al agregado de enzimas lipolíticas o a la adición y crecimiento de microorganismos productores de enzimas lipolíticas INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

29 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Sin agregado de agentes generadores de lipasas: características organolépticas poco pronunciadas, por ej. quesos blandos y semiduros C L A S I F Ó N Con agregado de lipasas fúngicas: aroma y sabor pronunciados, por ej. Roquefort, Stilton, Camembert Con agregado de lipasas gástricas o naturales: características organolépticas bien marcadas, por ej. Quesos duros italianos como Parmesano, Romano, Provolone INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

30 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Cuándo consideramos rancidez en un queso? - Dependerá del tipo de queso y se apreciará organolépticamente, estableciéndose una relacíón entre BDI y umbrales de percepción de rancidez. - Excesivos valores de AGLs dan sabores rancio, sucio o butírico. - La rancidez será responsabilidad de las lipasas bacterianas ya que las naturales de la leche se inactivan en las condiciones de pH y contenido de sal del queso. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

31 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004CONSECUENCIAS TECNOLÓGICAS Dificultad en el batido de la crema Pérdida de grasa en el suero de manteca Inhibir las bacterias de starters por FFA (leches fermentadas o cultivadas) Retardar y debilitar acciones del cuajo Disminuye el rendimiento quesero Baja la capacidad del espumado de la leche INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

32 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AGLsINTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

33 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Generalidades: No existe un método de Referencia Los métodos se pueden clasificar en: Determinan la “acidez global”⇒ Métodos de rutina Determinan individualmente cada AGL ⇒ métodos cromatográficos. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

34 Generalidades: Expresión de los resultados:mmol/100g de grasa ó mmol/l ⇓ Depende del método utilizado Métodos de aislación de los AGLs: Desestabilizan la emulsión y separan la grasa: BDI Extracción con solventes orgánicos:métodos cromatográficos, Deeth INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

35 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Aspectos a tener en cuenta en el análisis de AGLs: 1)Prevención e inhibición de la lipólisis: Inhibición química → no es la más adecuada, existen ejemplos de uso de Dicromato y H2O2. Inactivación térmica → se inactiva térmicamente la lipasa. Ejemplos: termisar las muestras hasta 72ºC en un baño y dejarlas 15s una vez alcanzada la T. Inhibición físico-química → se mezcla la muestra con la mezcla extractiva. Por ej.:en métodos con extracción con solventes, la grasa y los AGLs se extraen con una mezcla nopolar ácida ( la lipasa se inactiva a bajos pH ). INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

36 INTI-Lácteos PTM-Agosto 20042) Aislación de los AGLs: Método del batido Aislación de la grasa como tal Método BDI Método de Frankel y Tarassuk Extracción usando solventes orgánicos Método de Dole Método de Deeth Uso de ácido Salicílico INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

37 3) Determinación de los AGLs:Determinación de la acidez global Determinación de los AGL individuales Titulación Métodos Cromatográficos: GLC, HPLC Cambio de color en un indicador Análisis directo de los AGL Formación de complejos coloreados Análisis de los éstres metílicos INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

38 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Método de Deeth Se aplica a leche fluída y leche en polvo Procedimiento: 3 ml de leche + 10 ml mezcla ( Isopropílico:Epetrólero:H2SO4 4N) + 6 ml EP + 4 ml de H20 Se agita 15 seg y se deja en reposo 4 minutos se toman 5 ml de la capa superior Se agrega fenolftaleína Se titula con KOH metanólico 0.02 N INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

39 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Cálculos: ųequivalentes/ml de leche = V tit * N * 1000 P*Val donde Vtit = Volumen del titulante N = Normalidad del titulante P= Volumen alícuota/ Volumen capa supeior Val = Volumen de leche utilizada INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

40 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Método del BDI Acidez Titulable de la Grasa: es la cantidad de álcali requerida para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en una masa de grasa presente en la muestra. Se expresa en: mmoles de álcali/100 gr. de grasa. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

41 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Método del BDI Principio: Una cantidad de muestra (leche, crema, dulce de leche, queso) es mezclada cuidadosamente con una solución conteniendo Tetrafosfato de sodio y un agente tensioactivo, y calentando en un baño de agua hirviendo para separar la grasa. Una cantidad medida de grasa es disuelta en un solvente orgánico y titulada con álcali alcohólico. Precisión del método: mmoles /100 gr. de grasa. Repetibilidad: 0.05 mmoles/100 gr. de grasa. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

42 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Método del BDI Separación de la grasa - En un butirómetro para crema o queso cerrar uno de los extremos y llenar con 16  0.5 ml de leche  0.1 ml de reactivo de BDI. - Cerrar y homogeneizar en ángulos de 180 º por 10 veces. - Ajustar la escala con el tapón inferior. - Colocar en Baño María a 95 ºC durante 15 minutos hasta separación de la grasa. - El agua debe estar por arriba del nivel de la muestra. - Pasar a un Baño de 45 ºC hasta que la grasa alcance 45 ºC. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

43 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004Método del BDI Titulación gr. de grasa + 5 ml de Fat solventTitular con sn. valorada de TBHA 0.01 M hasta viraje de amarillo a verdoso en ausencia de CO2. BDI = x V x C = mmoles/100 gr. de grasa masa muestra INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

44 Método Cromatográfico de DeethSe aplica a leche y productos lácteos Se determinan los AGL sin previa esterificación Se extraen los AGL con mezcla ácida de Eter étílico y Hexano Se agrega estándar interno ( C5 ) La separación de los AGL se realiza pasando el extracto etéreo en columna de alúmina desactivada, los AGL quedan adsorbidos a la alúmina. Los AGL se desorben de la columna mediante el agregado de una mezcla de éter isopropílico con 6% de ácido fórmico. Se inyecta al GLC. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

45 Métodos para determinación de AGLsINTI-Lácteos PTM-Agosto 2004