1 Introducción a la InvestigaciónCentro de Microscopía Electrónica Facultad de Ciencias Médicas Módulo Optativo Introducción a la Investigación en el Área Biomédica Directora: Dra Cristina MALDONADO

2 OBJETIVO - Acercarlos a la Investigación Científica. Conocer la situación en Argentina Motivarlos en esta actividad o ayudarlos a discernir si tienen vocación para ella. Conocer a proyectos de investigación del Centro, su trayectoria, avances en la metodología utilizada, diseños experimentales, resultados Contactar con investigadores clínicos en nuestro medio Brindarles elementos básicos de técnicas de Biología celular y molecular para poder interpretar un trabajo científico de la especialidad - Ayudarlos a interpretar la lectura de trabajos científicos

3 Centro de Microscopía Electrónica1977- Dr. Agustín Aoki Directora: Dra. Alicia Inés TORRES (Dra. En Bioquímica-Invest. CONICET) Prof. Adjuntas: Dra. Cristina MALDONADO (Dra. En Bioquímica-Invest. CONICET) Dr. Jorge MUKDSI (Dr. en Medicina, Patólogo) Dra. Patricia PONS (Dra. en Medicina) Dra. Ana DE PAUL (Dra. en Biología-Invest. CONICET) Postdoctorados: Dra. Silvina GUTIERREZ (Dra. en Medicina-Invest. CONICET, Patóloga) Dr. Juan Pablo PETITI (Dr en Biología-Becario CONICET) Dr. Amado QUINTAR (Dr. en Medicina-Invest. CONICET) Tesistas: Carolina LEIMGRUBER (Bioquímica- Becaria CONICET) Liliana SOSA (Bioquímica- Becaria CONICET) Luciana GARCÍA (Médica- Becaria CONICET) Virginia JUAREZ (Bióloga-Profesor Asistente) Eugenia SABATINO (Bióloga- Becaria CONICET) Alicia VACA (Bioquímica- Profesor Asistente)

4 Docentes Invitados Dra. María Elisa Uribe, Neumonóloga del Hospital Italiano de Córdoba Dra. Inés Noher de Halac. Centro de Estudios de Metabolopatías Congénitas (CEMECO), Hospital de Niños de Córdoba

5 CRONOGRAMA 1- Introducción a la investigación. Qué es investigar? Concepto de investigación. Planteo de la hipótesis de trabajo, momentos de una investigación, Partes de un trabajo científico  Progresión de la línea de investigación que llevó al descubrimiento del Factor Natriurético por el Dr. De Bold  Progresión de la línea de investigación que llevó evidenciar el rol de Galectina-1 por el Dr. Rabinovich.  Modelos y diseños experimentales. 2- Literatura científica y Búsqueda bibliográfica 3- Procesos intracelulares de la célula: “Del estímulo a la respuesta”  Cómo siente y como responde la célula a señales desde el entorno. 4- Técnicas de Biología Celular y Molecular  Microscopio fotónico vs electrónico.  Procesamiento de muestras e inclusión en resinas plásticas.

6 4- Técnicas de Biología Celular y molecular- Técnicas para la evaluación de proteínas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo:  Western Blot y ELISA.  Análisis de proliferación y apoptosis  Inmunocitoquímica, inmunofluorescencia  Presentación de un trabajo científico en el que se usaron las técnicas. - Técnicas para estudios “in vitro”  Cultivo de tejido: Fundamento y aplicación en biomedicina.  Citometría de flujo.  Presentación de un trabajo científico integrados. - Técnicas de biología molecular  Hibridización in situ y PCR.  Microarray.  Presentación de un trabajo o trabajo práctico integrador.

7 5- Progresión de los proyectos de investigación del Centro. Mecanismos regulatorios involucrados en Proliferación y Muerte de Células de la Adenohipofisis.  Interacciones inmune-endocrinas.  Mecanismos de defensa de mucosas (inmunidad innata)

8 6- La investigación clínica: La investigación clínica: formas de trabajo en Argentina: experiencia personal con pacientes asmáticos crónicos. Dra. Uribe Echevarría  Terapia fotodinámica. Dra. Patricia Pons  Transición epitelio-mesenquimática en el carcinoma de células claras de riñón. Dr. Jorge Mukdsi  Del paciente a la mutación en patologías monogénicas de atesoramiento lisosomal. Dra. Inés Noher de Halac

9 7- La Microscopía Electrónica en el estudio de patologías Aporte de la microscopía electrónica en el diagnóstico de patologías renales  Aporte de la microscopía electrónica en otros diagnósticos médicos (Ej: patologías ciliares, patologías de esperma, músculo y nervios). 8- Actividad práctica  Visita al microscopía electrónica  Inmunomarcación en secciones de parafina

10 Qué es Investigación? Una investigación es un proceso sistemático, organizado y objetivo cuyo propósito es responder a una hipótesis planteada frente a un interrogante o pregunta, y así aumentar el conocimiento y la información sobre algo desconocido. Una pregunta o idea disparadora que plantea una hipótesis de trabajo Conocimiento previo en el área temática (marco teórico) Estrategia ordenada de trabajo Generar información nueva

11 (generales y específicos)Observación aislada un problema Espíritu observador Marco teórico Idea disparadora HIPÓTESIS DE TRABAJO Experimentación Objetivos (generales y específicos)

12 Inicio de la bacteriología modernaLouis Pasteur Inicio de la bacteriología moderna Marco teórico Observación aislada un problema Cómo se produce la generación de la vida Espíritu observador HIPÓTESIS DE TRABAJO No existe generación espontánea de la vida sino que ocurre contaminación con microorganismos provenientes del aire

13 Diseño Experimental

14 Refutó la Teoría de la Generación Espontánea,al demostrar que todo ser vivo procede de otro ser vivo. El principio científico fue la base de la Teoría germinal de las enfermedades, inicio de la Bacteriología moderna.

15 Idea disparadora Alexander Fleming Observación aislada un problemaDescubrimiento de la Penicilina Observación aislada un problema Inhibición bacteriana en una placa contaminada con hongo ambiental Marco teórico Espíritu observador Investigaba sobre Antimicrobianos naturales Descubrió la “lisosima” Idea disparadora HIPÓTESIS DE TRABAJO “Los hongos liberan alguna sustancia que inhibe el crecimiento Bacteriano”

16 Alexander Fleming Diseño experimental Descubrimiento de la PenicilinaEstreptococos Control positivo Agar Estreptococo Agar + Penicilium notatum Estreptococo Agar + Lisosima Inhibición del desarrollo bacteriano Control negativo Fleming A On the antibacterial action of cultures of a Penicillium, with special reference to their use in the isolation of –b. influence. British Journal of experimental Pathology 10: Fleming A. How I discovered penicillin.J Med (Oporto). 1950;15:683.

17 “La imaginación es más importante que el conocimiento”FRASES PARA PENSAR “La imaginación es más importante que el conocimiento” “Lo importante es no dejar de hacerse preguntas". "La formulación de un problema es más importante que su solución". Albert Einstein

18 Método Científico Construir una Análisis Bibliográfico profundoHipótesis cierta Analizar e interpretar resultados Realizar Informe, publicación falsa Replantear la hipótesis Construir una Construir Experimentar para probar la Realizarse una pregunta Método Científico

19 Etapas de la ExperimentaciónPLANIFICACIÓN Definir los objetivo (Generales y espécíficos) Diseños experimentales: in vivo o in vitro Determinar el o los parámetros variables (grupos experimentales) Definir las metodologías de estudio Muestras de estudios

20 Modelos experimentales (in vivo)Ratas machos de la cepa Wistar adultas castración Infección i.p PBS i.p. 24 hs 48 hs 72 hs Testosterona s.c. 7 días 3 días Sham vehículo s.c. 7 días 3 días Escherichia coli (108 en 200 ul) día 10

21 MATERIALES Y MÉTODOS 24 horas 48 horas PRÓSTATA VENTRAL 72 horasHOMOGENATO DOT BLOT WESTERN 24 horas ANÁLISIS MORFOLÓGICO 48 horas PRÓSTATA VENTRAL INMUNOCITOQUíMICA 72 horas CULTIVOS BACTERIANOS 30 días MATERIALES Y MÉTODOS

22 Gradiente discontinuoMATERIALES Y MÉTODOS Cultivo primario de Células Epiteliales Prostáticas (CE) y de Células Musculares Lisas prostáticas (CM). Ratas macho Cepa Wistar 3 meses Dispersión mecánica Dispersión Enzimática a 37ºC Próstata ventral DMEM Gradiente discontinuo de Percoll DMEM CE MCDB 131 CM

23 Etapas del método científicoPLANIFICACIÓN Diseños experimentales: in vivo o in vitro Determinar el o los parámetros variables Controles Muestras de estudio Definir las metodologías de estudio EJECUCIÓN Aplicación de los protocolos experimentales en grupos de 4-5 animales y repetidos 3 veces. Toma de muestras Análisis de los parámetros de interés

24 Etapas del método científicoPLANIFICACIÓN Diseños experimentales: in vivo o in vitro Determinar el o los parámetros variables Controles Muestras de estudio Definir las metodologías de estudio EJECUCIÓN Aplicación de los protocolos experimentales Toma de muestras Análisis de los parámetros de interés PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS Asegura objetividad en la valoración de los resultados

25 CAMBIOS ESTROMALES TGF -ACTINA * p<0,01 vs 5 díasp< 0,01 Vs Control * p<0,01 vs 5 días

26 Etapas del método científicoPLANIFICACIÓN Diseños experimentales: in vivo o in vitro Determinar el o los parámetros variables Controles Muestras de estudio Definir las metodologías de estudio EJECUCIÓN Aplicación de los protocolos experimentales Toma de muestras Análisis de los parámetros de interés PROCESAMIETO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS Asegura objetividad en la valoración de los resultados INFORME FINAL Se sacan conclusiones sobre si se aprueba o se rechaza la hipótesis

27 Resúmenes de trabajos Presentados en Sociedad Argentina de Investigación Clínica

28 Etapas del método científicoPLANIFICACIÓN Diseños experimentales: in vivo o in vitro Determinar el o los parámetros variables Controles Muestras de estudio Definir las metodologías de estudio EJECUCIÓN Aplicación de los protocolos experimentales Toma de muestras Análisis de los parámetros de interés PROCESAMIETO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS Asegura objetividad en la valoración de los resultados INFORME FINAL Se sacan conclusiones sobre si se aprueba o se rechaza la hipótesis GENERACIÓN DE CONOCIMIENTO NUEVO Publicación de los resultados Introducción de los mismos en la práctica??

29 INVESTIGACIÓN CLÍNICAINVESTIGACIÓN BÁSICA También llamada teórica o pura. Tiene el fin de incrementar los conocimientos científico pero sin contrastarlos con aspectos prácticos  Utiliza modelos experimentales, in vivo o in vitro  Amplia variedad de condiciones experimentales, variables a evaluar y muestras  Requiere tantos controles como sea necesario. INVESTIGACIÓN CLÍNICA También llamada práctica ó empírica. Persigue la aplicación de los conocimientos que alcanza (evaluar medicamentos, tratamientos, comparar métodos de estudio, caracterizar una patología, factores desencadenantes, etc.  Los grupos experimentales surgen entre los pacientes  Limitadas variables de ensayo y especímenes biológicos. Requiere controles  Requiere protocolos autorizados por Comités de Ética

30 Investigación ClínicaMuestra biológica parámetro a ensayar Técnica Orina hormonas, antígenos ELISA-Western Blot Suero o plasma anticuerpos ELISA-Western Blot Exudados enzimas ELISA-Western Blot Esputo inducido productos metabólicos técnica bioquímicas-ELISA Secreción uterina lípidos técnicas bioquímicas Semen iones técnicas bioquímicas Células exfoliadas cantidad, tipificación tinción especial, recuento Células sanguíneas Caracterización de espermatozoides antígenos de superficie citometría de flujo Tejidos de biopsias antígenos intracelulares inmunocitoquímica mRNA Hibridización in situ, PCR alteraciones morfológicas Microscopía electrónica y fotónica DNA estudios genéticos

31 Partes de un Trabajo Científico

32 Título autores Resumen Introducción

33 Metodologías

34 Resultados

35 Resultados y Discusión

36 REFERENCIAS

37 PÉPTIDO NATRIURÉTICO ATRIAL Línea de Investigación del Dr. Adolfo de Bold

38 PÉPTIDO NATRIURÉTICO ATRIALDr. Adolfo de Bold ANP es un péptido producido por los cardiocitos atriales de los mamíferos (miocardiocitos). Tiene potente actividad natriurética y diurética Es modulador de los sistemas que incrementan la presión sanguínea, como lo es la renina-angiotensina.

39 FACTOR NATRIURÉTICO ATRIAL: Dr. Adolfo de BoldObservación detonante de la investigación Electron microscopy of the atrium of the Guinea pig. Hisch B Exp. Med. Surg (1956) 14: A significant electron microscopic difference between the atria and the ventricles of the mammlian hear. Hisch B. Exp. Med. Surg. (1963) 21:

40 Los gránulos contendrían catecolaminas o las células se especializan en secreción además de la contracción??? Studies on cathecolamine-containing granules of specific cells in Cyclostoma hearts. Bloom G y col. Act Physiol. Scand. Suppl. (1961) 53:1-34. Secretory granules in the atrial rat. Palade G E. (1961) Anat Rec. 139:262.

41 FACTOR NATRIURÉTICO ATRIAL1º Hipótesis de estudio Los llamados gránulos específicos del corazón de la rata tienen un contenido proteico.

42 1° Objetivo específico: Explorar la naturaleza del contenido granularMATERIALES Y METODOLOGÍAS - Trabaja con el atrio de roedores para purificar una fracción rica en gránulos (el ventrículo sirve de control). - Seguimiento de las fracciones ricas en gránulos mediante microscopía electrónica - Análisis con técnicas histoquímicas (fucsina-aldehído).

43 1° Objetivo específico: Explorar la naturaleza del contenido granularRESULTADOS Studies on the relationship between the catecholamine distribution in the atrium and the specific granules present in atrial muscle cells Studies on the sedimentation pattern of atrial noradrenaline and adrenaline De Bold AJ, Bencosme SA. Cardiovasc Res. 1973;7:364-9 Atrial specific granules of the rat heart: light microscopic staining and histochemical reactions. de Bold AJ, Raymond JJ, Bencosme SA. J Histochem Cytochem. 1978;26:

44 Autoradiografía: introduce a.a. marcado con radioactivo RESULTADOS Autoradiografía: introduce a.a. marcado con radioactivo (leucina tritiada) Autoradiographic analysis of label distribution in mammalian atrial and ventricular cardiocytes after exposure to tritiated leucine. de Bold AJ, Bencosme SA. Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab. 1975;8:

45 1eras conclusiones Los gránulos de las células atriales no contienencatecolaminas. Los gránulos atriales son primariamente partículas de almacenamiento de polipéptidos conteniendo triptofano y aa sulfatados. Las células atriales tienen una doble actividad biológica, ya que sintetizan proteínas con dos cinéticas distintas: 1- propia de células contráctiles, 2- propia de células secretorias.

46 Investigar cambios en el contenido de gránulos atriales2º Objetivo: Investigar cambios en el contenido de gránulos atriales MATERIALES Y METODOLOGÍAS - Desarrollo de una tinción específica que permita cuantificar los gránulos (plomo-hematoxilina tartrazine). - Análisis de la variabilidad de los gránulos con la edad y cambios en el balance hidrosalino.

47 Investigar cambios en el contenido de gránulos atriales2º Objetivo: Investigar cambios en el contenido de gránulos atriales Selective light microscopic demonstration of specific granulation of the rat atrial myocardium by lead-hematoxylin-tartrazine. de Bold AJ, Bencosme SA. Stain Technol. 1975;50:203-5. Heart atria granularity effects of changes in water-electrolyte balance. de Bold AJ Proc Soc Exp Biol Med. 1979;161:508-11

48 FACTOR NATRIURÉTICO ATRIALHipótesis de estudio Los llamados gránulos específicos del corazón de la rata contienen una hormona polipeptídida involucrada en el control del agua y balance electrolítico.

49 Evaluar la actividad biológica de extractos atriales3º Objetivo: Evaluar la actividad biológica de extractos atriales MATERIALES Y METODOLOGÍAS Desarrollo de un Bioensayo: inyección de extractos atriales y ventriculares para observar efectos in vivo. presión sanguínea Hematocrito Diuresis y natriuresis en fluido tubular y medular (micro-catéteres)

50 Cambios en la presión sanguínea yel hematocrito

51 Cambios en el fluido tubular y medularExtractos derivados del músculo atrial, produjeron un incremento de 30 veces en la excreción de sodio y cloruro, mientras que el potasio se elevó al doble. Además, un aumento del volumen urinario en 10 veces. No se observan cambios al inyectar extractos ventriculares del mismo corazón o inyectando el medio usado para homogeneizar. Se concluye que el atrio induce incremento de la excreción de sodio, e inhibe su reabsorción tubular.

52 3º Objetivo: Evaluar la actividad biológica del homogenato de atrio A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats De Bold AJ, y col Life Sci. 28:89-94, 1981. Intrarenal localizacion of the natriuretic effect of cardiac atrial extract. Sonnenberg H, Cupples WA, de Bold AJ, Veress AT Can J Physiol Pharmacol (1982) 60:

53 Generar conocimiento nuevoAtrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. de Bold AJ. Science 1985; 15:

54 FACTOR NATRIURÉTICO ATRIALHipótesis de estudio El ANP se localiza en los gránulos atriales

55 - Purificación del péptido mediante cromatografía reversa 4° Objetivo específico Relacionar el ANP con los gránulos MATERIALES Y METODOLOGÍAS - Purificación del péptido mediante cromatografía reversa de alta presión (HPLC). - Determinación de la secuencia de aa, obtención de anticuerpos específicos. - Inmunocitoquímica para localizarlo en gránulos atriales.

56 4° Objetivo específico Relacionar el ANP con los gránulos Tissue fractionation studies on the relationship between an atrial natriuretic factor and specific atrial granules. de Bold AJ. Can J Physiol Pharmacol. (1982);60: Atrial natriuretic factor of the rat heart. Studies on isolation and properties. de Bold AJ. Proc. Soc. Exp. Biol Med. 170: The amino acid sequence of an atrial peptide with potent diuretic and natriuretic properties. Flynn TG, de Bold ML, de Bold AJ. Biochem Biophys Res Commun (1983) 117:859-65

57 FACTOR NATRIURÉTICO ATRIALCardiodilatin-immunoreactivity in specific atrial granules of human heart revealed by the immunogold stain. Anat Embryol (Berl). 1986;173:295-8. Maldonado CA, Saggau W Forssmann WG N Mi

58 5° Objetivo específico:Regulación y mecanismos de acción del ANF - Desarrollo de un bioensayo con preparaciones de atrio aislado de rata. - Autoradiografía con leucina tritiada - Desarrollo de un RIA para ANF

59 5° Objetivo específico: Regulación y mecanismos de acción del ANFStretch-secretion atrial natriuretic factor release utilizes a rapidly depleting pool of newly synthesized hormones. Mangat H, de Bold AJ. Effect of manipulations of Ca2+ environment on atrial natriuretic factor release. De Bold ML, De Bold AJ. Am J Physiol. 1989;256(6 Pt 2):H

60 On the shoulders of giants: the discovery of atrial natriuretic factorDe Bold AJ University of Ottawa Heart Institute. Ont., Canadá Can J Physiol Pharmacol (1987) 65: Natriuretic peptides and therapeutic applications Lee CY, Burnett JC Jr Heart Fail Rev. 2007; 12:131-42 The endocrine function of the hear MF Mc Grath, MLKuroski de Bold and AJ de Bold Trends in Endocrinology and Metabolism 2005; 10:

61 Qué es Investigación? “La investigación científica es una de las bases de la civilización actual. De ella dependen la salud, el bienestar, la riqueza, el poder y hasta la independencia de las naciones. Estamos en una era científica” Dr. Bernardo Houssay (Premio Nobel de Medicina, año 1947)