1 JORNADAS DE ACTUALIZACIONES EN HEMATOLOGÍA: ACTUALIZACIÓN DE LA LMAHospital Universitario La Fe 6 a 8 de Mayo de 2008

2 CARACTERIZACIÓN DE LAS LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDASHospital Universitario La Fe 6 de Mayo de 2008

3 CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA LMALourdes Cordón Lab. Citometría de Flujo Servicio de Hematología y Hemoterapia Hospital Universitario La Fe Valencia, 6 de mayo de 2008

4 CITOMETRÍA DE FLUJO Análisis multiparamétrico.Proporciona información sobre: - Tamaño (FSC) y complejidad (SSC) de las células. - Expresión de antígenos.

5 CITOMETRÍA DE FLUJO

6 DIAGNÓSTICO DE LA LMA DIAGNÓSTICO MORFOLOGÍA CLÍNICA CITOQUÍMICACITOGENÉTICA + FISH BIOLOGÍA MOLECULAR CITOMETRÍA DE FLUJO

7 VENTAJAS DE LA CMF EN EL DIAGNÓSTICO DE LA LMARapidez. Especificidad. Elevada sensibilidad (10-4 ó 10-5). Análisis objetivo y reproducible.

8 OBJETIVOS DE LA CFM EN LMAIdentificación línea: linfoide ó mieloide. Nivel de diferenciación. Detección de perfiles inmunofenotípicos anómalos. Diagnóstico de: LMA M0 LMA M7 LA bifenotípicas LA bilineales

9 OBJETIVOS DE LA CFM EN LMAInmunofenotipo de células raras: Células dendríticas. Mastocitos. Correlación con alteraciones citogenéticas específicas. Valor pronóstico del inmunofenotipo. Evolución: - Detección y seguimiento de EMR.

10 EXPRESIÓN ANTÍGENICA Línea granulocítica: CD11b, CD13, CD15, CD16, CD33, CD65, CD117, MPOc. Línea monocítica: CD11b, CD11c, CD14, CD36, LISOZIMAc. Línea eritroide: glicoforina A, CD71. Línea megacariocítica: CD41, CD42, CD61. Línea B: CD10, CD19, CD22, CD79ac. Línea T: CD2, CD3c, CD4, CD7. Línea NK: CD16, CD56. Antígenos no específicos de línea: 7.1, CD34, CD45, HLA-DR.

11 PANEL INICIAL FITC PE PerCP APC Control CD4 CD8 CD3 CD16 CD19 CD45HLA-DR CD2 CD5 CD7 CD36 CD13 CD15 CD117 CD61

12 PANEL LMA FITC PE PerCP APC CD34 CD22 CD38 CD45 CD19 CD14 HLA-DR CD4GA CD33 CD56 CD9 CD11c CD41 CD11b CD123 CD13 CD65 7.1 MPOc CD79ac CD3c TdTc IgMc

13 MADURACIÓN MONOCÍTICAMONOBLASTO MONOBLASTO PROMONOCITO MONOCITO 103 HLA-DR HLA-DR CD33 CD33 102 CD13 CD13 CD15 CD15 CD36 CD36 CD11b CD11b 101 CD117 CD117 CD14 CD14 CD34 CD34 CD11c CD11c (Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

14 MADURACIÓN GRANULOCÍTICAMIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO SEGMENTADO CD13 103 CD117 102 CD33 CD11b CD15 CD34 CD16 101 CD65 HLA-DR CD10 (Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

15 MADURACIÓN ERITROIDE 103 CD71 Glicoforina A CD34 CD117 102 HLA-DR CD45PROERITROBLASTO ERITROBLASTO HEMATÍE 103 CD71 Glicoforina A CD34 CD117 HLA-DR 102 CD45 101 (Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

16 MADURACIÓN MEGACARIOCÍTICAINMADURO MADURO 103 CD36 CD41 CD42 CD61 102 CD34 HLA-DR CD117 101 (Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

17 LMA: CLASIFICACIÓN FABLeucemia Serie M0 Mieloblástica mínimamente diferenciada Granulocítica M1 Mieloblástica sin maduración M2 Mieloblástica con maduración M3 Promielocítica M4 Mielomonocítica Granulocítica y monocítica M5 Monoblástica/monocítica Monocítica M6 Eritroide Eritroblástica y granulocítica M7 Megacarioblástica Megacariocítica

18 CLASIFICACIÓN FAB: INMUNOFENOTIPOWood B. Multicolor immunophenotyping: Human immune system hematopoiesis. Methods Cell Biol 2004; 75:

19 LMA: CLASIFICACIÓN MIC-MAnomalía cromosómica Subtipo FAB Genes participantes t(8;21)(q22;q22) M2/M4 eto / aml-1 t(15;17)(q22;q21) M3 pml / rarα inv(16)(p13;q22) / t(16;16) M4-Eo myh-11 / cbfβ t(9;11)(p21-22;q23) M5 af-9 / hrx t(11;19)(q23;p13.1) mll / ell t(11;19)(q23;p13.3 mll / enl t(?;11)(?;q23) M4/M5 hrx t(6;9)(q23;q34) dek / can t(8;16)(p11;p13) moz / cbfβ inv(3)(q21;q26) / t(3;3) M4 evi-1 / evi-1 t(1;3)(p36;q21) t(3;21)(q26;q22) evi-1? / aml-1 t(9;22)(q34;q11) M1 abl /bcr t(1;22)(p13;q13 M7

20 LMA: CLASIFICACIÓN EGILLínea mielomonocítica: α-MPO+, CD13+, CD33+, CD65+ y/o CD117+ (al menos dos marcadores positivos). Línea eritroide (M6): Inmaduro: inclasificable por marcadores. Maduro: Glicoforina A +. Línea megacariocítica (M7): CD41+ y/o CD61+ (de superficie o citoplasmáticos); habitualmente CD34+, CD33+ y/o CD13+. Mieloide (M0): Inmunofenotipo idéntico a las de linaje mielomonocítico con citoquímica negativa para MPO y con antígenos específicos de línea linfoide (CD3, CD79a, CD22) negativos. LMA TdT+. LMA con marcadores linfoides (Ly+LMA).

21 LMA: CLASIFICACIÓN EGILScore Linfoide B Linfoide T Mieloide 2 CD79ac CD3 ó CD3c MPO IgMc Anti-TCR CD22c 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 0,5 TdT CD65 CD24 CD14 CD7 CD15 CD1a CD64 Una puntuación de 2,5 se considera suficiente para asignar linaje. CD79a puede ser también expresado en una subpoblación de leucemia / linfoma linfoblástico T.

22 LMA: CLASIFICACIÓN OMSLMA con traslocaciones citogenéticas recurrentes: - LMA t(8;21)(q22;q22) (aml-1/eto) (M2) - LMA-Eo inv(16)(p13;q22) ó t(16;16)(p13;q11) (cbfβ/myh-11) (M4-Eo) - LMA 11q23 (mll) - LPA t(15;17)(q22;q11-12) y variantes (pml-rarα) (M3) LMA con displasia multilineal. LMA secundarias a tratamiento previo.

23 LMA: CLASIFICACIÓN OMSLMA no clasificable en otra categoría: - Leucemia mieloide aguda indiferenciada (M0) - Leucemia mieloide aguda mínima maduración (M1) - Leucemia mieloide aguda con maduración (M2) - Leucemia aguda mielomonocítica (M4) - Leucemia aguda monocítica (M5a y M5b) - Leucemia aguda eritroide (M6) - Leucemia aguda megacariocítica (M7) - Leucemia aguda con basofilia (M2 con basofilia) - Panmielosis aguda con mielofibrosis - Leucemias agudas bifenotípicas

24 LMA M0 INMUNOFENOTIPO: Bajo SSC/FSC Marcadores mieloides positivosMPO-/+ CD13+ CD33-/+ CD117+ Marcadores linfoides negativos Incidencia 2% - 7% MPO- por citoquímica ó <3% SSC/FSC

25 LMA M0 CD45/SSC CD34/SSC CD117/SSC CD13/SSC CD33/SSC

26 LMA M1 INMUNOFENOTIPO: No fenotipo característico Bajo SSC/FSCIncidencia 15% - 20% Blastos ≥ 90% C.N.E. MPO+ ≥ 3% por citoquímica INMUNOFENOTIPO: No fenotipo característico Bajo SSC/FSC MPO+ CD13+ CD33+ CD34+ CD15-/+

27 LMA M2 INMUNOFENOTIPO: CD34-/+ HLA-DR-/+ CD117-/+ CD13+ CD33+ MPO++Incidencia 30% Blastos 30% - 89% C.N.E. MPO+ INMUNOFENOTIPO: CD34-/+ HLA-DR-/+ CD117-/+ CD13+ CD33+ MPO++ CD15+/++ CD11b+

28 LMA M3 INMUNOFENOTIPO: Alto SSC/FSC MPO++h CD13+ CD33+ CD117+Incidencia 5% - 15% FSC/SSC INMUNOFENOTIPO: Alto SSC/FSC MPO++h CD13+ CD33+ CD117+ CD34- HLA-DR- CD2-/+ (M3v) AUTOFLC.

29 LMA M3 CD117/SSC CD13/CD45 SSC/CD45 HLA-DR/CD45 CD45/CD34 CD33/CD45

30 LMA M3 Sistema de puntuación inmunofenotípica de la M3:- CD13 + patrón heterogéneo - Patrón maduración CD15/CD34 - Población mayoritaria Otros antígenos significativos: - CD33 + patrón homogéneo - HLA-DR - CD15 CD34 CD34 CD33 CD34 CD13 Orfao et al. Haematologica 1999, 84:

31 LMA M3 Técnica PGM3: OTRAS LMA M3

32 LMA M4 INMUNOFENOTIPO: Blastos: Bajo SSC/FSC CD13+ CD33+ CD34+Incidencia 15% - 20% INMUNOFENOTIPO: Blastos: Bajo SSC/FSC CD13+ CD33+ CD34+ CD117+ CD11c+d Monocitos: CD34- CD117- CD11b+ CD11c++ HLA-DR+ CD14++ CD64+

33 LMA M4 FSC/SSC CD45/SSC CD34/SSC CD13/SSC CD33/SSC MPOc/SSC CD11c/SSC

34 LMA M5 Incidencia 15% M5a M5b

35 LMA M5 INMUNOFENOTIPO: CD4 + CD36 + CD14 + LISOZIMAc + SSC/FSCCD56/SSC CD14/CD45 CD13/CD33 CD11c/CD15 CD2/CD117

36 LMA M6 INMUNOFENOTIPO: Glicoforina A+ CD71+ CD34+ CD36+ CD71/CD45Incidencia 4% - 5% CD71/CD45 SSC/CD45 INMUNOFENOTIPO: Glicoforina A+ CD71+ CD34+ CD36+ CD34/CD45 GA/CD34

37 LMA M7 Muy infrecuente Morfología indiferenciada MPO- CD61/SSC

38 LMA M7 INMUNOFENOTIPO: CD41+ CD42a+ CD42b+ CD61+ CD45- ó + MPO-FSC/SSC CD61/SSC CD41/SSC CD61/SSC MPOc/SSC

39 LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICAIncidencia: < 3% de las LA Coexpresión de antígenos de dos ó más líneas.

40 LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICA (EGIL)Score Linfoide B Linfoide T Mieloide 2 CD79ac CD3 ó CD3c MPO IgMc Anti-TCR CD22c 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 0,5 TdT CD65 CD24 CD14 CD7 CD15 CD1a CD64 Una puntuación de 2,5 se considera suficiente para asignar linaje. CD79a puede ser también expresado en una subpoblación de leucemia / linfoma linfoblástico T.

41 LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICALA bifenotípica (mieloide y linfoide T)

42 LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICA LA bifenotípica (mieloide y linfoide B)CD19/CD33 CD19/CD79ac CD19/MPOc LA bifenotípica (mieloide y linfoide B)

43 LEUCEMIA AGUDA BILINEALIncidencia: < 1% de las LA Identificación de dos ó más clones de diferente línea celular.

44 LEUCEMIA DE CÉLULAS DENDRíTICASINMUNOFENOTIPO: CD HLA-DR++ CD4+ CD56 + CD7.1+ MPOc- CD3c- CD79ac- Feuillard J. et al. Blood 2002; 99: Bueno C. et al. Haematologica 2004 HLA-DR/CD123 CD56/SSC HLA-DR/CD56

45 LEUCEMIA AGUDA DE MASTOCITOSINMUNOFENOTIPO: CD117+++ Mastocitos neoplásicos: SSC monocitos CD2+ CD25+ (más frecuentemente positivo) CD11c+ FSC/SSC CD117/SSC CD117/CD45 Escribano et al, Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 2004; 58B; 1-8.

46 CORRELACIÓN CON ALTERACIONES CITOGENÉTICAS ESPECÍFICASAdaptado de Orfao et al. Cytometry Part A 58ª:

47 LMA: ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL- Diagnóstico: 1. Inmunofenotipos leucémicos 2. Diseño de paneles de seguimiento específicos - Evolución: 3. Muestras adecuadas 4. Aplicación de los paneles de seguimiento 5. Adquisición en “segunda ventana”

48 LMA: ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUALSensibilidad de la CMF % Blastos en M.O. Recaída MORFOLOGÍA CITOGENÉTICA 5% PCR CITOMETRÍA EMR 10-5 E.Indetectable Tiempo

49 LMA: ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUALInconvenientes: - EMR: > 80% de LMA - Expresión en células leucémicas con el mismo fenotipo de células normales - Dificultad: > 2 clones leucémicos - Procesamiento muestras antes de 6 horas PETHEMA LMA2007: - Momento: post-inducción en RC morfológica: - EMR < 0,1% Negativa - EMR > 0,1% Positiva

50 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOS- Infidelidad de línea. - Asincronismos madurativos. - Infra- ó sobreexpresión. - Fenotipos ectópicos.

51 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOSInfidelidad de Línea FSC/SSC CD19/CD15 CD19/MPO CD19: linfoide B / CD15 y MPO: mieloide

52 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOS Asincronismo MadurativoCD34/CD22 CD34: inmaduro CD22: B maduro CD34/CD22

53 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOS Sobreexpresión AntigénicaCD19/CD10+++ CD19/CD10

54 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOSFenotipos ectópicos Detección de células con inmunofenotipo típico de un tejido en una localización anormal. Por ejemplo: Células T CD4+/CD8+ normales en timo, detectadas en adenopatía, LCR, etc.

55 PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOSSan Miguel JF et al. Blood 2001

56 LMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICOCD34 Blastos inmaduros Mal pronóstico CD56 Localización extramedular (LPA) Mal pronóstico en subgrupo de t(8;21) y t(15;17) CD7 Mal pronóstico LMA inmaduras (M0, M1 en relación con citogenética de mal pronóstico) CD2 En LMA muy mal pronóstico, excepto si hay inv(16): baja tasa de RC

57 LMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICOPresencia de EMR post-inducción: factor pronóstico importante asociado a recaídas. n EMR SLR / Rec Evaluación San Miguel Blood 1997 ;90:2465. Blood 2001; 98:1746 126 (44) < 10-4 > < 10-3 > < 10-3 > 10-2 100% SLR a 3 años 85% 55% 15% RC Venditti Blood 2000; 96:3948 63 > 3,5 x 10-4 < 3,5 x 10-4 17 / 22 (77%) 5 / 29 (17%) Tras Consolidación Kern Blood 2004; 104:3078 62 log-diff > 2,28 log-diff < 2,28 26% SLR a 2 años 83% RC y Tras C Feller1 Leukemia 2004; 18:1380 51 > 1% < 1% RR 6.1 Coustan-Smith2 Br J Haematol 2003; 123:243 46 >0,1% <0,1% 33% SLR a 3 años 72% Perea Leukemia 2005; e-public 55 67% SLR a 2 años 21% Fin del tto Haematol; 2004; 89:528 106 65% SLR a 2 años 37% Día +16

58 DIAGNÓSTICO INTEGRADOCONCLUSIÓN CITOMETRÍA DE FLUJO LÍNEA CELULAR ESTADIO MADURATIVO PERFIL INMUNOFENOTÍPICO FACTORES PRONÓSTICO EMR MORFOLOGÍA CITOQUÍMICA DIAGNÓSTICO INTEGRADO CITOGENÉTICA + FISH BIOLOGÍA MOLECULAR CLÍNICA

59 GRACIAS