1 Kinetyka reakcji enzymatycznychEnzymologia-9 Kinetyka reakcji enzymatycznych

2 Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

3 Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu stacjonarnego

4 Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu przedstacjonarnego

5 Kinetyka reakcji enzymatycznejModel Michelisa-Menten

6 KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCHRównanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń: a. Założenie równowagi k2 << k-1 wprowadzając , oraz: v = k2 [E:S], jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [Ec] = [E] + [E:S], otrzymuje się ostatecznie: , lub , gdzie kkat = k2 to stała katalityczna Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [Ec], to: V = kkat[Ec] Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem Ks.

7 b. Założenie stanu ustalonego = 0;= k1 [E][S] – (k-1[E:S] + k2[E:S]) wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się: v = Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - KM. Warto zauważyć, że KM = Ks , czyli KM = Ks, jeżeli k2<

8 GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCHRównanie Lineweavera-Burka

9 2. Równanie Eadiego-Hofstee3. Równanie Hanesa

10 Bezpośredni wykres liniowy

11 Znaczenie parametrów kinetycznychKM – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie KM lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli KM jest bliskie Ks, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu. V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> KM. Stanowi miarę efektywności katalitycznej. W warunkach fizjologicznych [S]/KM mieści się zwykle między 0,01 a 1,0. W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta, a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli kkat). Prawdziwa jest przybliżona zależność: (przy czym [E]  [E]c) a stosunek kkat/KM jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.

12 Znaczenie parametru (i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu podstawiając [Ec] = [E] + [E:S] i pamiętając, że , otrzymujemy i ostatecznie gdzie pozorna drugorzędowa stała szybkości jeżeli [S1] = [S2], to

13 Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1 (ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi? Z założenia stanu ustalonego: Jeżeli k2>>k-1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to: , czyli: Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k1  109 M s-1 Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens, natomiast, jeżeli << 109, to właściwsze jest założenie równowagi. Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy M-1s-1 osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalityczna jest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

14 KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCHMechanizm tworzenia kompleksu E + A + B  [E:A:B]  [E:P:Q]  E + P +Q Kompleks może się tworzyć w sposób: -         uporządkowany (ordered binding) E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] E + B nie tworzą [E:B] -         przypadkowy (random binding) E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] E + B  [E:B] [E:B] + A  [E:A:B] b. mechanizm ping-pong E + A  E + P E + B  E + Q

15 - - dla mechanizmu ping-pongMODEL OGÓLNY WIĄZANIA KA i KB – stałe Michaelisa dla każdego z substratów przy wysycających stężeniach drugiedrugiego substratu V – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów RÓWNANIA KINETYCZNE - dla mechanizmu tworzenia kompleksu -         - dla mechanizmu ping-pong

16 OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A0] utrzymując stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzie Lineweavera-Burke’a. Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega z utworzeniem kompleksu Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v Tworzy się wykresy wtórne

17 b. Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiegamechanizmem ping-pong Jedyny wykres wtórny:

18 HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCHStosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne: KES = KM; KEI = KI

19 HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCHZałożenie ograniczające: KESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S V= V; KM > KM Inhibicja kompetytywna

20 HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCHZałożenie ograniczające: KESI = KEI; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I V< V; KM = KM Inhibicja niekompetytywna

21 HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCHZałożenie ograniczające: KEI = ; I łączy się tylko z ES V< V; KM < KM Inhibicja pozakompetytywna