1 CHROMATOGRAFIA cz. II PODZIAŁ METOD I ICH ZASTOSOWANIE DETEKTORY ANALIZA JAKOŚCIOWA/ILOŚCIOWA

2 KLASYFIKACJA METOD CHROMATOGRAFICZNYCHRodzaj metody Geometria układu Technika (Format) Chromatografia cieczowa (LC) Chromatografia bibułowa (PC) planarna podział Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) planarna adsorpcja, podział, wymiana jonowa, wykluczanie Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) kolumnowa adsorpcja, podział, Chromatografia nadkrytyczna (SFC) kolumnowa podział Chromatografia gazowa (GC) Chromatografia gaz-ciecz (GLC) kolumnowa podział Chromatografia gaz-ciało stałe (GSC) kolumnowa adsorpcja

3 Chromatografia bibułowa (PC)Format – planarna Mechanizm sorpcji (technika) – podział Nośnik – bibuła Faza stacjonarna – ciekła – woda zawarta w higroskopijnej bibule. Faza ruchoma – rozpuszczalnik organiczny lub mieszanina rozpuszczalników. Rozpuszczalnik używany jest do rozwijania chromatogramu i do kondycjonowania bibuły przez jej nasycenie parami.

4 Chromatografia bibułowa (PC)Komory do chromatografii bibułowej – różne naczynia o kształtach prostopadłościennych, cylindrycznych, a nawet próbówki. Nanoszenie próbki – podlega zasadom ogólnym chromatografii. Próbki nanoszone są w postaci roztworów w rozpuszczalnikach łatwo lotnych. Substancja rozdzielana przenoszona jest wraz z fazą ruchomą, ulegając podziałowi pomiędzy dwie niemieszające się ciecze: eluent i wodę związana z bibułą. Identyfikacja – porównanie z wzorcem chromatografowanym równocześnie.

5 Chromatografia bibułowaMetody zależne od rodzaju przepływy eluentu po powierzchni bibuły: Metoda wstępująca – brzeg bibuły zawieszonej linią startową do dołu zanurzony jest w pojemniku z rozpuszczalnikiem. Metoda zstępująca lub spływowa – brzeg bibuły zawieszonej linią startową do góry zanurzony jest w korytku z rozpuszczalnikiem podwieszonym u góry komory chromatograficznej. Stosowane są paski lub arkusze bibuły prostokątne lub kwadratowe.

6 Chromatografia bibułowaMetoda pierścieniowa – bibuła leży poziomo, a rozpuszczalnik doprowadzany jest do punktu centralnego chromatogramu, gdzie naniesiony został roztwór mieszaniny. Bibuła ma w tym przypadku kształt krążków.

7 Chromatografia bibułowaMetoda dwuwymiarowa lub dwukierunkowa – stosowana w przypadku niewystarczającego rozdzielenia składników po pierwszym rozwinięciu chromatogramu. Rozpuszczalnik migruje w dwóch kierunkach prostopadłych. Zwykle stosowane są też dwa różne rozpuszczalniki. Zwiększa to możliwość precyzyjnej identyfikacji. Arkusze bibuły są tu kwadratowe. Metoda elektrochromatografii – rozpuszczalnik porusza się w polu elektrycznym do 400V. Jest to przypadek połączenia chromatografii z elektroforezą. Stosowany wyłącznie do rozdziału substancji ulegających jonizacji lub silnie polarnych.

8 Chromatografia bibułowaKilka dziesiątek lat temu była jedyną metodą stosowaną w analizie biochemicznej do wykrywania, rozdzielania oraz oznaczania aminokwasów, peptydów, białek, kwasów nukleinowych, cukrów i innych substancji w płynach ustrojowych. Jest to metoda prosta i wygodna do oceny czystości związku oddawanego do analizy elementarnej. Obecnie rzadko stosowana.

9 Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)Format – planarna Mechanizm sorpcji – podział, adsorpcja, wymiana jonowa, wykluczanie Nośnik – płytki szklane, aluminiowe, plastikowe

10 Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)Faza stacjonarna – drobnoziarniste sorbenty stałe o wielkości ziarna µm – żel krzemionkowy, celuloza, żywice jonowymienne, tlenek glinu, ziemia okrzemkowa, selektory chiralne. Grubość warstwy sorbentu 0,2-2,5 mm. Może zawierać nierozpuszczalny odczynnik fluorescencyjny. Faza ruchoma – rzadko pojedyncze rozpuszczalniki, często mieszaniny rozpuszczalników o różnej polarności – od niepolarnych węglowodorów do polarnych alkoholi, wody oraz rozpuszczalników kwasowych i zasadowych. Rozpuszczalnik porusza się dzięki siłom kapilarnym.

11 Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)Komory elucyjne – różne naczynia o kształtach prostopadłościennych, cylindrycznych lub typu horyzontalnego. Szczelnie zamknięte i wypełnione parami fazy ruchomej. Nanoszenie próbki – podlega zasadom ogólnym chromatografii. Substancja rozdzielana przenoszona jest wraz z fazą ruchomą przez płaskie złoże fazy stacjonarnej metodą pionową (wstępującą) lub horyzontalną. Identyfikacja – spryskiwanie odczynnikiem wywołującym reakcję barwną lub wskaźnikiem fluorescencyjnym dla obserwacji w świetle UV.

12 Fazy ruchome w chromatografii TLCCzęsto dobierane doświadczalnie. Popularne jest mieszanie dwóch rozpuszczalników - można łatwo regulować ich zdolność elucyjną w celu zoptymalizowania rozdzielenia przez zmianę stosunków podziału substancji. Ogólne wskazówki dotyczące wyboru i optymalizacji składu fazy ruchomej: - Rozpuszczalniki powinny być najwyższej czystości - TLC jest bardzo czułą techniką analityczną. - Zdolność elucyjną fazy ruchomej tak regulować, aby wartości Rf mieściły się w zakresie 0,2-0,8 – rozdzielczość największa.

13 Inne procedury TLC Dwuwymiarowa TLC – stosowana dla pełnego rozdzielenia substancji o podobnych właściwościach chemicznych. Pojedynczą próbkę rozwija się po naniesieniu w polu startowym umieszczonym w rogu płytki. Składniki są częściowo rozdzielone wzdłuż jednego boku płytki. Chromatogram po wysuszeniu i obróceniu o 90 o rozwijany jest ponownie z użyciem fazy ruchomej o innym składzie. Otrzymuje się dwuwymiarową mapę składników.

14 Inne procedury TLC Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC) Oznaczenie prowadzone jest według reguł klasycznej TLC. Stosowane są płytki pokryte cieńszą warstwą (0,1 mm grubości) bardzo drobnoziarnistego sorbentu (średnia wielkość ziarna 5 µm). Zwiększa się czułość i rozdzielczość rozdziału. Odczyty chromatogramów prowadzone są przy pomocy densytometru.

15 Wykrywanie rozdzielonych składników (analiza jakościowa)Większość rozdzielanych substancji jest bezbarwna, ich plamki należy zlokalizować przez zastosowanie odpowiedniej wizualizacji: - Spryskiwanie płytki odczynnikiem chromogennym (zawierającym w cząsteczce grupy chromoforowe), który reaguje ze wszystkimi rozdzielanymi substancjami lub tylko z zawierającymi specyficzne grupy funkcyjne i tworzy barwne połączenia (barwne plamki). Czasami trzeba płytki podgrzać, aby przyspieszyć reakcję i wzmocnić zabarwienie.

16 Wykrywanie rozdzielonych składników (analiza jakościowa)- Oglądanie płytki w świetle lampy UV (o długości fali 254 nm lub 366 nm) - obserwuje się wtedy ciemne plamki substancji lub jaskrawo fluoryzujące plamki na tle jednolitej fluorescencji. - Spryskiwanie płytki stężonym kwasem siarkowym lub azotowym i ogrzewanie w celu utlenienia i zwęglenia organicznych substancji, których plamki stają się brązowe lub czarne. - Wystawianie płytki na działanie par jodu w zamkniętej komorze – wiele substancji organicznych zabarwia się na ciemnobrązowo.

17 Wykrywanie rozdzielonych składników (analiza jakościowa)- Skanowanie powierzchni płytki densytometrem, tzn. przyrządem, który mierzy natężenie promieniowania odbitego od powierzchni po naświetleniu jej promieniowaniem nadfioletowym lub widzialnym. Substancje, które absorbują promieniowanie, odpowiadają zarejestrowanym pikom. - Substancje znakowane wskaźnikami promieniotwórczymi można wykrywać przez wykonanie autoradiogramu (film fotograficzny zaczerniony pod wpływem promieni rentgenowskich), liczenie scyntylacji zdrapanych porcji fazy stacjonarnej lub monitorowanie powierzchni płytki za pomocą licznika Geigera-Müllera.

18 Oznaczenie składu mieszaniny (analiza ilościowa)Metody bezpośrednie – poprzez pomiar powierzchni plamki. Do pomiaru używa się planimetru. Uwzględniana jest grubość warstwy sorbentu i aktywność substancji. Również nanoszone są na tę samą płytkę substancje wzorcowe w znanej ilości. Fotodensytometria – w oznaczeniu stosowany jest pomiar światła odbitego lub przepuszczonego – głównie UV/VIS, analizowany w aparacie rejestrującym. Fluorymetria – pomiar natężenia światła emitowanego przez substancje fluoryzujące. Oznaczenie pośrednie w eluatach – sorbent z powierzchni płytki zawierający plamkę ekstrahowany jest rozpuszczalnikiem a roztwór badany poddaje się analizie instrumentalnej (NMR, IR, UV lub innej).

19 Fotodensytometria w TLC

20 Zalety i wady chromatografii planarnejMożliwość chromatografowania wielu próbek równocześnie, np. w celu natychmiastowego i bezpośredniego porównania z wzorcem; Możliwość zastosowania wszystkich mechanizmów sorpcji; Podstawowa technika jest tania, wszechstronna i szybka; Możliwość wykrycia wszystkich substancji rozdzielanych, łącznie z tymi, które nie migrują z punktu startu. Wady: Ograniczona powtarzalność wyników; Zmiany w składzie fazy ruchomej w czasie rozwijania chromatogramu; Wzrastające rozmycie plamki (poszerzenia pasma) powodowane zmniejszeniem szybkości fazy ruchomej wraz z pokonywaną odległością.

21 Zastosowanie chromatografii planarnejUmożliwia badanie zanieczyszczeń, które mogą występować w środkach farmaceutycznych. Można ją zastosować do wyodrębnienia pojedynczego składnika z mieszaniny i uzyskania go w ilości pozwalającej na wykonanie innych szczegółowych badań analitycznych. Zastosowanie densytometrii oraz skanowanie chromatogramów TLC – pozwalają na ilościowe oznaczenie rozdzielonych substancji z dużą czułością i dokładnością. Stosuje się często w tzw. analizie przesiewowej (farmaceutycznej, biomedycznej, toksykologicznej) - wykrycie określonych składników próbki i poddanie jej dalszej analizie bardziej dokładnymi i precyzyjnymi metodami w przypadku pozytywnego wyniku z pierwszego etapu.

22 Chromatografia gazowa (GC)Format – kolumnowa Mechanizm sorpcji (technika) – podział (gaz-ciecz GLC), adsorpcja (gaz-ciało stałe GSC). Wymywanie analitów w kolejności rosnącej temp. wrzenia Nośnik – ściana kolumny, drobnoziarniste ciało stałe Faza stacjonarna – wysokowrzące ciecze, oleje, woski, stałe drobnoziarniste adsorbenty Kolumny – długie, wąskie rurki kapilarne (otwarte) z fazą stacjonarną pokrywającą ściany lub krótkie rurki o większej średnicy, wypełnione sorbentem (kolumny pakowane). Faza ruchoma – obojętny gaz oczyszczany w absorbentach, a dostarczany z butli przez zawory regulujące ciśnienie i przepływ. Azot stosowany do kolumny pakowanej, hel w kolumnach kapilarnych.

23 Chromatografia gazowa (GC)Dozowanie próbki – gazowe, ciekłe lub stałe – wprowadzane przez dozownik (mikrostrzykawka, zawór) do fazy ruchomej na szczycie kolumny w postaci roztworu 0,5-20 µL. Rozpuszczalnik zostaje usunięty. Regulacja temperatury – kolumny znajdują się w termostatowanych piecach. Temperatura rozdziału jest stała lub regulowana (wzrastająca w czasie rozdziału). Temperatura elucji oC. Identyfikacja – substancje rozdzielane wykrywane są w fazie ruchomej w kolejności elucji przez detektory. Detektor generuje sygnał elektryczny. Chromatogram stanowi wykres zależności stężenia od czasu retencji.

24 Chromatografia gazowa (GC)Chromatograf gazowy składa się z podstawowych części: zbiornik gazu i regulatorów - Gaz nośny (faza ruchoma) doprowadzony z butli płynie przez regulator przepływu do dozownika, a następnie przez kolumnę i detektor, skąd jest usuwany na zewnątrz do atmosfery. dozownik próbki (mikrostrzykawka lub zawór) - Do dozownika wprowadza się próbkę, która po odparowaniu w dozowniku, miesza się ze strumieniem gazu nośnego i następnie jest przenoszona do kolumny.

25 Chromatografia gazowa (GC)kolumna w termostatowanym piecu (utrzymywana jest stała lub programowana temperatura, stopniowo wzrastająca w czasie rozdzielania), W kolumnie następuje rozdział chromatograficzny składników próbki, które opuszczają kolumnę wraz z gazem nośnym i trafiają kolejno do detektora. układ detekcyjny i rejestrujący - Składniki próbki są monitorowane w detektorze generując w nim sygnał elektryczny. mikrokomputer z oprogramowaniem do sterowania przyrządem i przetwarzania danych.

26 Kolumny stosowane w GC pakowane (kolumny z wypełnieniem): analityczne, mikropakowane i preparatywne pakowane (F= 2 – 6mm; L =1-3m) mikropakowane (F= 0,8 – 1,2mm; L =kilkanaście m) preparatywne (F > 6mm; L = kilka m) kolumny o przekroju otwartym – kapilarne kapilarne (F= 0,2 – 0,6mm; L =kilkadziesiąt m) mikrokapilarne (F < 0,1 mm; L = kilkadziesiąt m)

27 Kolumny stosowane w GC Kolumny pakowane napełnione są fazą stacjonarną w całej swojej objętości. Długość – 1-3 m, ze stali nierdzewnej lub szklane, średnica wewnętrzna 2-3 mm, wypełnienie z granulatu, jako stałego nośnika w GLC lub jako adsorbent w GSC. Stały nośnik - obojętny, porowaty materiał krzemionkowy, bardzo drobny. Faza stacjonarna: - ciecz pokrywająca cienki nośnik dla GLC - porowaty stały adsorbent lub polimer dla GSC

28 Kolumny stosowane w GC Kolumny kapilarne pozwalają na osiągnięcie dużo wyższych sprawności niż kolumny pakowane i obecnie większość analiz chromatograficznych wykonuje się przy zastosowaniu kolumn kapilarnych. Rurki długie ( m), wykonane z kwarcu, średnica 0,1-0,7 mm. Fazy stacjonarne: bardzo cienka warstwa cieczy pokrywająca bądź chemicznie związana z wewnętrzną ścianą – GLC, WCOT bardzo drobno sproszkowane ciało stałe – GCS, PLOT

29 Kolumny stosowane w GC Wyróżnia się następujące rodzaje kolumn kapilarnych: WCOT (wall-coated open tubular) – kapilary ze ściankami wewnętrznymi pokrytymi nielotną ciekłą fazą stacjonarną. Jest to najbardziej popularny typ kolumn. SCOT (support-coated open tubular) – ziarna wypełnienia pokryte są fazą ciekłą. - PLOT (porous layer open tubular) – kapilary ze ściankami pokrytymi warstwą ziaren adsorbenta.

30 Fazy stacjonarne stosowane w GCChromatografia gaz-ciało stałe, GSC Adsorbenty węglowe, żele krzemionkowe, sita molekularne, polimery porowate. Adsorbenty stosuje się do analiz gazów i węglowodorów o niskich masach cząsteczkowych. Chromatografia gaz-ciecz, GLC - fazy niepolarne: węglowodory będące dobrymi rozpuszczalnikami substancji niepolarnych, np. skwalan.

31 Fazy stacjonarne stosowane w GCfazy średniopolarne: silikony. Są to siloksany o różnej masie cząsteczkowej: polidimetylosiloksan, polimetylofenylosiloksan, policyjanoalkilosiloksan. - fazy polarne: glikole polietylenowe (np. Carbowax) oraz estry. - fazy polarne oparte o kopolimery styrenu i diwinylobenzenu.

32 Fazy ruchome stosowana w GCGazy o małej gęstości, niskiej lepkości, w których współczynniki dyfuzji są duże. Najczęściej jest to: wodór, azot, argon lub hel. Rodzaj gazu nośnego ma niewielki wpływ na wynik rozdziału chromatograficznego. Zadaniem gazu jest transport próbki przez dozownik, kolumnę i detektor. Przy wyborze gazu nośnego należy się kierować przede wszystkim rodzajem wybranego detektora oraz ceną, dostępnością i czystością gazu. Wymagana czystość gazów wynosi >99,999%.

33 Detektory stosowane w GCDetektor reaguje sygnałem elektrycznym na obecność chromatografowanego związku chemicznego w gazie nośnym opuszczającym kolumnę. Detektory można podzielić na: nieselektywne – detektory uniwersalne, reagują na wszystkie składniki próbki, selektywne – reagują na pewną grupę związków, które mają podobne właściwości chemiczne lub fizyczne, specyficzne – reagują na pojedynczy związek chemiczny.

34 Detektory stosowane w GCCechy idealnego układu detekcyjnego: Odpowiednia czułość. Stosowane aktualnie detektory zapewniają czułość w zakresie od 10-8 do gramów substancji na sekundę. Stabilność i odtwarzalność. Liniowa odpowiedź w zakresie kilku rzędów wielkości stężeń analitów. Zakres temperatur pracy od temperatury pokojowej do 400oC.

35 Detektory stosowane w GCKrótki czas odpowiedzi, niezależny od natężenia przepływu. Niezawodność oraz prostota obsługi (odporny na działania niedoświadczonych operatorów). Podobne odpowiedzi względem wszystkich analitów lub wysoka przewidywalność odpowiedzi dla jednego lub kilku rodzajów substancji. Nieniszczący charakter względem analizowanej próbki.

36 Detektory stosowane w GCDetektor płomieniowo-jonizacyjny (Flame Ionization Detector - FID) - najczęściej stosowany detektor w chromatografii gazowej (GC). W detektorze FID próbka ulega spaleniu w płomieniu powstałym w wyniku spalania wodoru w syntetycznym powietrzu. W płomieniu tworzą się jony i swobodne elektrony.

37 Detektory stosowane w GCDetekcja jest związana z pomiarem prądu wytworzonego przez te nośniki ładunku. Detektor ten zapewnia dużą czułość (ok g/s) oraz szeroki zakres prostoliniowości (ok. 107). Jest odporny i łatwy w użyciu. Wada – niszczenie próbek w czasie etapu spalania.

38 Detektory stosowane w GCDetektor cieplno-przewodnościowy (Thermal Conductivity Detector - TCD) –termokonduktometryczny, katarometr Ogrzewane źródło – drut platynowy, złoty lub wolframowy zmienia oporność w zależności od temperatury zmieniającej się wraz ze zmianą przewodności cieplnej gazu przepływającego. TCD wykorzystuje fakt, że wartość przewodnictwa cieplnego dla poszczególnych gazów różni się bardzo wyraźnie, natomiast przewodnictwo cieplne mieszaniny gazów jest funkcją jej składu. TCD ma umiarkowaną czułość i ograniczony zakres dynamiczny, jest bardziej odpowiedni do badań jakościowych niż ilościowych.

39 Detektory stosowane w GCDetektor wychwytu elektronów (Electron Capture Detector - ECD) Najbardziej czuły z detektorów GC, szczególnie wtedy, gdy gazem nośnym jest argon zamiast azotu. Reaguje selektywnie na związki zawierające chlorowce, siarkę oraz związki nienasycone, które mają duże powinowactwo elektronowe. Jego zaletą jest nieniszczący charakter względem analizowanej próbki. Ma ograniczony zakres liniowy.

40 Detektory stosowane w GCSpektrometr mas Jeden z lepszych detektorów w GC. Połączenie chromatografii gazowej i spektrometrii mas określa się jako GC-MS. W spektrometrze mas mierzona jest wartość stosunku masy do ładunku (m/z) jonów, które powstają z próbki. Służy głównie do analizy związków o niskich masach cząsteczkowych.

41 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)Format – kolumnowa Mechanizm sorpcji (technika) – podział, adsorpcja, wymiana jonowa, wykluczanie, powinowactwa i chiralna. Składniki rozdzielają się na podstawie szybkości migracji zależnej od powinowactwa do faz. Nośnik – ściana kolumny, drobnoziarniste ciało stałe. Faza stacjonarna – modyfikowana krzemionka, niemodyfikowana krzemionka, żywice polimerowe, żele. Kolumny – proste rurki ze stali nierdzewnej (dł cm, śr. 4,5-10 mm) wypełnione fazą stacjonarną drobnoziarnistą lub polimerem. Faza ruchoma –mieszanina rozpuszczalników (do czterech składników). Organiczne rozpuszczalniki niepolarne do wodnych roztworów buforowych. Dostarczane po przejściu przez system odgazowania, filtracji i mieszania na szczyt kolumny pompą stałoprzepływową.

42 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)Dozowanie próbki – ciekłe próbki i roztwory wprowadzane przez dozownik (zawór) do fazy ruchomej na szczycie kolumny. Identyfikacja – substancje rozdzielane wykrywane są w fazie ruchomej w kolejności wypływu przez detektor – zależność stężenia od czasu. Detektory – absorpcyjny; fluorescencyjny; elektrochemiczny, FTIR; spektrometr mas; refraktometryczny; konduktometryczny.

43 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)Wysokosprawny chromatograf cieczowy składa się z podstawowych części: układ dostarczania rozpuszczalnika dozownik próbki kolumna układ detekcji i rejestracji mikrokomputer z oprogramowaniem do sterowania przyrządem i przetwarzania danych.

44 Kolumny HPLC W kolumnie następuje proces rozdzielenia, dlatego jest ona centralnym elementem aparatu HPLC. Dwa typy kolumn do HPLC: Konwencjonalny O małej średnicy Zalety kolumn o małej średnicy: mniejsze, o ok. 80% zużycie rozpuszczalnika, z powodu dużo mniejszego natężenia przepływu fazy ruchomej; małe objętościowe natężenie przepływu powoduje, że te kolumny są idealne do połączenia ze spektrometrem mas; zwiększona czułość, ponieważ rozdzielane składniki są bardziej stężone (użyteczne przy ograniczonej wielkości próbki, np. przy próbkach klinicznych).

45 Kolumny HPLC Kolumny o małej średnicy nie są tak mocne jak kolumny konwencjonalne, nie są konieczne w wielu rutynowych zastosowaniach. Kolumny: - mikrokolumny - analityczne - preparatywne.

46 Materiał wyjściowy stosowany do otrzymywania związanych faz stacjonarnych typu RPżel krzemionkowy tlenek glinu di-tlenek tytanu di-tlenek cyrkonu polimery organiczne (np. kopolimer styrenu i diwinylobenzenu, poliamidy, polimetakrylany)

47 Żel krzemionkowy Na powierzchni żelu krzemionkowego wyróżnia się trzy rodzaje miejsc aktywnych wynikających z obecności grup hydroksylowych tj. wolne (a), bliźniacze (b) i tzw. zasocjowane (c) grupy hydroksylowe.

48 Otrzymywanie niepolarnych faz związanych typu RPOpiera się na reakcji powierzchniowych grup OH z odpowiednimi silanami. Reakcję z monochlorosilanem można przedstawić w uproszczeniu za pomocą równania : R jest łańcuchem węglowodorowym (C18, C8, C4, grupą fenylową, alkilodifenylową, itp.), albo inną grupa funkcyjną (alkilonitryl, alkiloamina, aklilodiol itp.), decydującą o charakterze i właściwościach powierzchni otrzymanego sorbentu. Jest to przykład fazy “monomerycznej”, w której z jednym atomu krzemu związana jest jedna cząsteczka silanu.

49 Schemat struktury powierzchni modyfikowanego żelu krzemionkowegoModyfikacja alkilochlorosilanami: na powierzchni pozostały resztowe grupy -OH, powierzchnia dezaktywowana trimetylochlorosilanem, na powierzchni pozostały nieliczne grupy –OH, c) faza spolimeryzowana.

50 Schemat żelu krzemionkowego z chemicznie związaną grupą n-oktylodimetylosililowąC8, RP8

51 Fazy ruchome stosowane w HPLCFaza ruchoma (eluent) - ciecz (najczęściej jest to mieszanina rozpuszczalników) wtłaczana pod wysokim ciśnieniem, która charakteryzuje się odpowiednią zdolnością elucyjną i zapewnia odpowiednią rozdzielczość. Faza ruchoma powinna być tak dobrana aby była jednocześnie rozpuszczalnikiem dla próbki. Jeśli to niemożliwe - należy wybrać taki rozpuszczalnik, który miesza się z fazą ruchomą i ma zbliżoną do niej moc elucyjną.

52 Fazy ruchome stosowane w HPLCElucję w czasie rozwijania chromatogramu można prowadzić w sposób izokratyczny lub gradientowy. Elucja izokratyczna - stosuje się pojedynczy eluent lub mieszaninę, której skład w trakcie analizy jest stały. Gdy zastosowanie elucji izokratycznej nie daje dobrego rozdzielenia pików przeprowadzimy elucję gradientową.

53 Wymagania wobec eluentuSkładniki eluentu muszą być wzajemnie mieszalne. Nie mogą chemicznie reagować ani wzajemnie z sobą, ani z fazą stacjonarną, ani z substancjami rozdzielanymi, wyłączając tworzenie par jonowych i inne zamierzone działania, wpływające na selektywność rozdzielania. Nie powinny też reagować z tymi materiałami konstrukcji aparatu chromatograficznego, które mają kontakt z eluentem.

54 Wymagania wobec eluentuNiska lepkość eluentu wpływa na: obniżenie ciśnienia pracy aparatu, zwiększenie okresu miedzy-naprawczego pompy, umożliwia stosowanie dłuższej kolumny, albo wypełnienia o mniejszych ziarnach.

55 Wymagania wobec eluentuW warunkach preparatywnego wykorzystania chromatografii cieczowej, ale także w przypadku stosowania niektórych rodzajów detektorów (np. MS, LC-FID), ważne znaczenie ma niskie ciepło parowania eluentu, niska temperatura wrzenia i nieobecność nielotnych substancji. W przypadku wykorzystywania detektorów spektrofotometrycznych eluent nie powinien absorbować światła w tych zakresach długości fali, które będą wykorzystywane do detekcji.

56 Wymagania wobec kolumnyNie powinno się dopuszczać do wyschnięcia kolumny: - może wówczas nastąpić „pęknięcie” wypełnienia nawet dobrze upakowanej kolumny (tak, jak pęka powierzchnia wysuszonego mułu) - co zdecydowanie pogarsza sprawność rozdzielania i bez ponownego napełnienia kolumny problemu, najczęściej, nie daje się usunąć. Kolumny nie powinno się poddawać mechanicznym udarom, ani w sposób gwałtowny obniżać ciśnienia eluentu: - może nastąpić osiadanie wypełnienia kolumny, pogorszenie profilu przepływu cieczy i obniżenie sprawności rozdzielania.

57 Wymagania wobec próbkiPróbka zawierająca zanieczyszczenia mechaniczne powinna przed dozowaniem do kolumny zostać przefiltrowana przez filtr membranowy (np. 0,45 μm). Nie powinna zawierać substancji trwale sorbowanych na powierzchni wypełnienia kolumny. Stosowanie tzw. „kolumn ochronnych - prekolumn” w celu przeciwdziałania skutkom tego typu zanieczyszczeń jest dość mało skuteczne. Obecność substancji trwale sorbowanych powoduje najczęściej systematyczny spadek retencji oznaczanych składników próbki (czasem wzrost retencji niektórych substancji), tym szybszy, im zawartość zanieczyszczeń w próbce jest wyższa.

58 Wymagania wobec próbkiNajkorzystniejszym rozpuszczalnikiem substancji dozowanych do kolumny HPLC jest eluent, albo ciecz o składzie odpowiadającym początkowemu składowi eluentu w warunkach elucji gradientowej. Należy dozować jak najmniejszą objętość jak najbardziej rozcieńczonej próbki. Należy przestrzegać zaleceń producenta kolumny: co do granicznych wartości pH eluentu co do składników eluentu, których nie należy stosować w przypadku określonego typu wypełnienia kolumny - trwałe uszkodzenie kolumny.

59 Detektory systemu HPLCSpektrometryczny UV-VIS – najczęściej stosowany. Źródło światła - niskociśnieniowa lampa rtęciowa umożliwiająca pomiar absorpcji w zakresie 200 – 600 nm; typową analityczną długością fali - promieniowanie o λ= 254 nm - długość fali absorbowana jest przez większość związków organicznych. Dokonuje pomiaru absorbancji rozdzielanych składników zawierających grupy chromoforowe. Czułość detektora UV-VIS jest bardzo wysoka i dla silnie absorbujących związków dochodzi do g oznaczanej substancji. Odmiany – fotometr z filtrami; spektrofotometr o zmiennej długości fali (wykres dwuwymiarowy); typu photodiode-array wyposażony w dwa lub więcej szeregi fotodiod (wykres trójwymiarowy).

60 Detektory systemu HPLCWyróżnia się trzy typy detektorów spektrofotometrycznych: 1. Fotometry z filtrami, najprostsze, pracujące przy określonej długości fali, w których źródłem promieniowania jest lampa rtęciowa, a za pomocą filtrów wybierane jest promieniowanie o długości fali np. 254, 280, 334 i 436 nm. Mają ograniczone zastosowanie, ponieważ nie są uniwersalne, ale za to tanie.

61 Detektory systemu HPLC2. Spektrofotometry o zmiennej długości fali są bardziej uniwersalne - umożliwiają pomiar przy każdej długości fali w zakresie pracy detektora, z optymalnym sygnałem od każdego eluowanego składnika. Jako źródeł promieniowania używa się w nich lamp deuterowych i wolframowych odpowiednio do zakresu UV i VIS, monochromator stanowi siatka dyfrakcyjna, a detektorem jest fotopowielacz.

62 Detektory systemu HPLC3. Detektory typu photodiode-array: Przez próbkę w kuwecie przepływowej przechodzi światło polichromatyczne w zakresie UV-VIS i dopiero za kuwetą jest rozszczepiane na siatce dyfrakcyjnej. Następnie światło pada na zestaw fotodiod rozmieszczonych liniowo, tak, że każda z diod rejestruje tylko wąski (rzędu 2 nm) zakres światła. Z funkcjonalnego punktu widzenia jest to jakby zestaw równocześnie pracujących detektorów obejmujących swym zakresem całe widmo UV-VIS.

63 Detektory systemu HPLCZalety detektorów typu photodiode-array - możliwość rejestrowania całego widma UV-VIS dla każdej z eluowanych substancji ; - możliwość sprawdzania czystości eluowanego piku – eliminuje możliwość przeoczenia nakładających się substancji; - daje możliwość korekcji linii podstawowej w przypadku wzrostu absorbancji na skutek stosowania gradientu.

64 Detektory systemu HPLCRefraktometryczny różnicowy – najbardziej uniwersalny. Opiera się na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła między czysta fazą ruchomą a fazą zawierającą wymywany składnik. Zasadniczą wadą tego detektora jest wysoka wrażliwość na nawet małe zmiany temperatury - wymaga stabilizacji temperatury ± 0,001 oC aby osiągnąć czułość 10-7 jednostki współczynnika załamania. Jest więc detektorem mało wygodnym w użyciu. Ponadto detektor ten wyklucza stosowanie gradientu fazy ruchomej. Mniej czuły od spektrometrycznego, cenny w przypadku rozdzielania związków nasyconych (cukry, alkany).

65 Detektory systemu HPLCFluorymetryczny – reaguje selektywnie na substancje fluoryzujące. Około 100 razy czulszy (dla związków fluoryzujących) i znacznie bardziej selektywny niż detektor UV. Wykorzystuje zjawisko fluorescencji tj. emisji światła przez substancję wzbudzone wysokoenergetycznym promieniowaniem UV. Jest detektorem selektywnym, gdyż związki mogą zostać wzbudzane tylko światłem o określonej długości fali. Emitowane promieniowanie mierzone jest fotopowielaczem ustawionym pod kątem 90o do źródła wzbudzenia. Detektor ten może wykrywać pikogramowe ilości (10-12 g) substancji. Stosuje się go często w analityce wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). Źródła wzbudzenia - takie jak te używane w konwencjonalnych spektrofluorymetrach: lampy rtęciowe, lampy ksenonowe, kwarcowe lampy halogenowe oraz lampy deuterowe.

66 Detektory systemu HPLCInne detektory Detektor konduktometryczny - zasada działania opiera się na pomiarze przewodnictwa, stosowany jest w chromatografii jonowej. Elektrochemiczny – pomiar przewodności dla substancji jonowych lub prądu w reakcji elektrochemicznego utlenienia lub redukcji. Do tej grupy zaliczają się detektory kulometryczny i detektor polarograficzny. Detektorów tych zwykle używa się przy fazach zawierających wodę Spektrometr mas – możliwość identyfikacji wszystkich substancji. Wymaga usunięcia rozpuszczalnika i przeprowadzenia próbki w stan gazowy.

67 Odmiany HPLC Chromatografia adsorpcyjna – w normalnym lub odwróconym układzie faz. Substancje rozdzielane konkurują o dostęp do grup silanolowych fazy stacjonarnej i wymywane są z kolumny w kolejności wzrastającej polarności. Chromatografia podziałowa zmodyfikowana – fazy stacjonarne to modyfikowane chemicznie krzemionki. Mechanizm sorpcji substancji na takich fazach to zmodyfikowany podział, bo chociaż związane węglowodory nie są prawdziwymi cieczami, cząsteczki organicznego rozpuszczalnika z fazy ruchomej tworzą na powierzchni sorbentu warstwę cienką. Najpopularniejszą fazą jest C18 (ODS), rozdzielenie prowadzi się w odwróconym układzie faz.

68 Odmiany HPLC Chromatografia jonowymienna - metodą polegająca na wymianie jonów na jonitach. Jonity - nierozpuszczalne ciała stałe, zawierające zdolne do wymiany jony – kationy lub aniony. W zetknięciu z roztworem elektrolitu jony te mogą być wymieniane w stosunku stechiometrycznie równoważnym na jony początkowo obecne w roztworze. Wymieniacze kationów nazywa się kationitami, natomiast anionów – anionitami. Reakcje wymiany jonowej prowadzi się najczęściej w kolumnach.

69 Odmiany HPLC TYPY WYMIENIACZY JONOWYCH a) Kationit (kwas związany na powierzchni porów wypełnienia kolumny): mocny, średni, albo słaby – konkurencyjne oddziaływania z kationami: b) Anionit (zasada związana na powierzchni wypełnienia kolumny): mocny, średni, albo słaby - konkurencyjne oddziaływania z anionami: c) wymieniacze jonów z dodatkowymi oddziaływaniami sorpcyjnymi, np. jednocześnie grupy typu C18 oraz -SO3H, albo/i NR4+OH.

70 Odmiany HPLC Eluent w chromatografii jonowejFazy ruchome zawierają jony przeciwnego znaku (przeciwjony) względem ładunków elektrycznych na powierzchni wymieniaczy jonowych. Substancje jonowe silnie dysocjujące, chromatografowane słabym eluentem, silnie oddziałują z wymieniaczem i mają długie czasy retencji. Substancje chromatografowane słabo dysocjujące nie mogą wypierać jonów osadzonych na wymieniaczu jonowym z eluentu o silnym charakterze jonowym i mają bardzo krótkie czasy retencji. Siła jonowa jest najważniejszym czynnikiem charakteryzującym eluent w chromatografii jonowymiennej. Na właściwości eluentu wpływa też pH i obecność modyfikatora organicznego.

71 Odmiany HPLC Chiralna chromatografia cieczowa Najbardziej efektywna technika pozwalająca na rozdzielenie enancjomerów i sprawdzenie ich czystości optycznej. Chiralne fazy stacjonarne (cyklodekstryny związane z krzemionką) rozdzielają enancjomery związków.

72 Odmiany HPLC Chromatografia żelowa, wykluczania zależnego od wielkości cząstek, sitowa GPC - Gel Permeation Chromatography; SEC - Size Exclusin Chromatography Rozdział ze względu na wielkość związku, służy do rozdziału związków wielkocząsteczkowych (białka, kwasy nukleinowe). - Składniki próbki o największych wymiarach cząsteczek, a więc o największej masie cząsteczkowej, albo penetrują najmniejszą część porów, tzn. tylko pory o największych średnicach, do których są w stanie wniknąć, albo płyną między ziarnami.

73 Odmiany HPLC Chromatografia żelowa, wykluczania zależnego od wielkości cząstek, sitowa GPC - Gel Permeation Chromatography; SEC - Size Exclusin Chromatography - Cząsteczki o najmniejszych wymiarach, a więc o najmniejszej masie penetrują wszystkie pory, stąd ich retencja jest największa. Substancje o pośrednich rozmiarach, a więc o pośrednich masach cząsteczkowych i pośrednich wartościach współczynnika dyfuzji, wnikają do tych porów, które są dostatecznie dużych rozmiarów, stąd ich retencja jest pośrednia.

74 Odmiany HPLC Chromatografia żelowa, wykluczania zależnego od wielkości cząstek, sitowa Stosowany eluent powinien być obojętny zarówno w stosunku do substancji chromatografowanej, jak i do wypełnienia kolumny; jego jedynym zadaniem jest przenoszenie składników chromatografowanej mieszaniny wzdłuż kolumny. Gdy wypełnienie stanowią organiczne stacjonarne fazy hydrofobowe, wówczas fazami ruchomymi są rozpuszczalniki średnio polarne: dichlorometan, chloroform, toluen lub tetrahydrofuran. Gdy wypełnienie kolumny stanowi polarny związek nieorganiczny, eluentem musi być woda, ewentualnie alkohole. Wodne fazy ruchome stosuje się także w przypadku faz stacjonarnych takich jak Sepharose i Sephadex.

75 Chromatografia fluidalnaChromatografia płynem nadkrytycznym (SFC - supercritical fluid chromatography) Nowa metoda chromatograficzna, łącząca cechy chromatografii gazowej i cieczowej. Jako fazę ruchomą wykorzystuje gaz w warunkach nadkrytycznych (np. dwutlenek węgla w temp. powyżej 31°C i 73 atm.), w których zanikają różnice pomiędzy fazą ciekłą i gazową.

76 Chromatografia fluidalnaStosowana jest m.in. do rozdziału substancji trudno rozpuszczalnych, gdyż fazy nadkrytyczne wykazują zdolność do rozpuszczania substancji złożonych z dużych, niepolarnych cząsteczek, np. wyższych alkanów lub węglowodorów poliaromatycznych. Gęstość płynu w stanie nadkrytycznym sprawia, że ma on dobre właściwości rozpuszczalnikowe, substancje rozpuszczają się w nim jak w cieczy, podobnie jak w chromatografii cieczowej. Mała lepkość płynu i niskie napięcie powierzchniowe powodują, że jego współczynnik dyfuzji jest wyższy niż dla cieczy, co skutkuje szybszym przenoszeniem masy, podobnie jak w chromatografii gazowej.

77 Chromatografia powinowactwa (Affinity Chromatography)stosuje się w biochemii i w biotechnologii pozwala na rozdzielenie mieszanin substancji dzięki wykorzystaniu specyficznych oddziaływań biologicznych; takie oddziaływania można zaobserwować pomiędzy przeciwciałami i antygenami (zasada klucza i dziurki do klucza), enzymami i substratami, enzymami i inhibitorami lub hormonami i receptorami. Są to bardzo specyficzne oddziaływania między dwiema substancjami, decydujące o bardzo dobrej selektywności rozdzielenia. Jedna z tych substancji jest reaktywnym ligandem, związanym chemicznie z powierzchnią nośnika i tworzy fazę stacjonarną, drugą substancją jest analit, wykazujący powinowactwo do ligandu.

78 Chromatografia powinowactwa (Affinity Chromatography)Wykorzystuje się tu najczęściej przeciwciała lub enzymy unieruchomione na nośniku. Jeśli w próbce występuje odpowiedni antygen lub substrat, to jest on selektywnie zatrzymywany na kolumnie.

79 Zalety i wady HPLC Wada: koszty!Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe stosowanie gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie związków (pole powierzchni pod pikiem); zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów. Wada: koszty!

80 Analiza ilościowa w technikach chromatograficznychTechniki chromatograficzne należą do metod porównawczych, które wymagają kalibracji względem wzorców. Analiza ilościowa w technikach chromatograficznych opiera się na tym, że ilość (masa lub stężenie) składnika próbki jest proporcjonalna do powierzchni (lub wysokości) jego piku. Analizę można wykonać poprzez porównywanie powierzchni (lub wysokości) piku analitu z powierzchnią (lub wysokością) piku wzorca o znanej masie lub stężeniu.

81 Analiza ilościowa w technikach chromatograficznychMierzony parametr (pole powierzchni lub wysokość piku) jest funkcją stężenia (lub masy) chromatografowanej substancji: Pp = f (c); Pp = f (m) hp = f (c); hp = f (m) Pp – pole powierzchni piku, hp – wysokość piku, c – stężenie substancji chromatografowanej, m - masa substancji chromatografowanej.

82 Analiza ilościowa w technikach chromatograficznychNajczęściej stosujemy trzy metody analizy ilościowej: – metoda krzywej kalibracyjnej (wzorca zewnętrznego, kalibracja bezwzględna), – metoda wzorca wewnętrznego, – metoda dodatku wzorca.

83 Metoda krzywej kalibracyjnejPrzygotowuje się szereg roztworów o znanych stężeniach substancji analizowanych (roztwory wzorcowe) oraz tzw. ślepą próbę – roztwór, w którym są wszystkie składniki roztworów wzorcowych z wyjątkiem analitu. Wykonuje się analizę chromatograficzną każdego roztworu i mierzy się pole powierzchni (lub wysokość) piku substancji analizowanej.

84 Metoda krzywej kalibracyjnejMetodę krzywej kalibracyjnej stosuje się wtedy, kiedy znamy dokładnie objętości roztworów dozowane do chromatografu (najlepiej dozować dokładnie taką samą objętość każdego roztworu wzorcowego). Mierzony parametr (pole powierzchni lub wysokość piku) jest funkcją liniową stężenia. Pp = a∙c + b hp = a∙c + b Pp – pole powierzchni piku hp – wysokość piku c – stężenie substancji chromatografowanej a –współczynnik kierunkowy prostej b – wartość stała

85 Metoda krzywej kalibracyjnejZależność mierzonego parametru (pola powierzchni lub wysokości piku) od stężenia związku można przedstawić graficznie. Pp (hp) Pp (hp) Pp = a∙c +b hp = a∙c + b Pp = a∙c hp = a∙c c [mg/ml] c [mg/ml]

86 Metoda wzorca wewnętrznegoW metodzie wzorca wewnętrznego do badanej próbki dodaje się określoną ilość wzorca (substancji standardowej), dobrze oddzielającego się w danych warunkach analizy od wszystkich badanych składników próbki. Wzorzec powinien mieć właściwości fizykochemiczne maksymalnie zbliżone do właściwości substancji badanej, nie może być składnikiem analizowanej próbki, poza tym powinien być nielotny w warunkach przechowywania, trwały i dostępny w postaci czystej.

87 Metoda wzorca wewnętrznegoRównania krzywej kalibracyjnej dla analitu i dla wzorca, który jest inną substancją, nie będą identyczne. Metodę wzorca wewnętrznego można zastosować, jeżeli wartości b w obu równaniach będą równe zeru. Ppa = aa∙ca Ppw = aw∙cw hpa = aa∙ca hpw = aw∙cw Ppa, Ppw – pole powierzchni piku analitu/wzorca hpa, hpw – wysokość piku analitu/wzorca aa, aw– współczynnik kierunkowy prostej ca, cw– stężenie analitu/wzorca w próbce dozowanej do chromatografu

88 Metoda wzorca wewnętrznegoWspółczynnik odpowiedzi (f) jest wartością charakterystyczną dla określonej pary związków chemicznych, analitu i wzorca wewnętrznego, zależną od warunków przeprowadzanej analizy. hpa/hpw = (aa∙ca)/(aw∙cw) f = aa/aw hpa/hpw = f∙ca/cw

89 Metoda dodatku wzorca Metodę dodatku wzorca stosujemy, jeżeli równanie krzywej kalibracyjnej ma przebieg prostoliniowy, zaś wartość b jest równa zeru. Objętość aplikowanej próbki (na kolumnę lub płytkę chromatograficzną) musi być stała.

90 Metoda dodatku wzorca Procedura oznaczeń: – pobieramy dwie identyczne próbki 1 i 2, – przygotowujemy próbkę 1 i wykonujemy analizę chromatograficzną mierząc pole powierzchni lub wysokość piku analitu, – do próbki 2 dodajemy znaną ilość wzorca, który jest badaną substancją (analitem), – roztwór mieszamy i wykonujemy analizę chromatograficzną mierząc pole powierzchni lub wysokość piku analitu.

91 Metoda dodatku wzorca c = h1cw/(h2 - h1)Stężenie analitu wyznaczyć można na podstawie układu dwóch równań: h1 = a∙c h2 = a(c + cw) c = h1cw/(h2 - h1)