1 LA IDENTIDAD DE LOS FRAGMENTOS DE DNARamon Rosselló-Móra Marine Microbiology Group Institut Mediterrani d’Estudis Avançats (CSIC-UIB)

2 Mayr & Simpson (-50 years)La idea de unidad taxonómica surge de la suposición de una creación divina Aristotle (-2400 years) genus species Linnaeus (-300 years) kingdom class order genus species Mayr & Simpson (-50 years) kingdom phylum subphylum superclass class infraclass cohort superorder order infraorder superfamily family subfamily tribe subtribe genus subgenus species subspecies ►un solo sistema ► toda la diversidad (MONISMO) ►  de categorias respuesta a  nuevas clasificaciones! ► El sistema ES artificial Rosselló-Mora 2005, J.Bacteriol. 187:

3 La definición de unidad va mejorando con el desarrollo tecnológico(Woese) (Venter) (Bergey) (Watson & Crieg) < 60’s Identificación fenotípica 60’s Descubrimiento del DNA hibridaciones DNA-DNA Análisis del GC 90’s use del RNAr como cronómetro molecular >00’s Genómica y metagenómica

4 El concepto de especie en TAXONOMÍA¿qué es una especie? El concepto de especie en TAXONOMÍA

5 ESPECIE (concepto filo-fenético)¿qué es una especie? CONCEPTO ESPECIE (concepto filo-fenético) “es una categoría que circunscribe (preferentemente) grupos genómicos coherentes y monofiléticos de aislados/cepas individuales que comparten un elevado grado de similitud en (muchos) caracteres independientes, comparados utilizando métodos estandarizados” Rosselló-Mora & Amann 2001, FEMS Rev. 25:39-67

6 ¿qué es una especie? DEFINICIÓN70-50% 70% genomic coherence Reasociación DNA-DNA G+C, AFLP, MLSA Comparaciones genómicas (ANI; AAI) 100% 60% 70% 80% 50% phenotypic coherence metabolismo quimiotaxonomía Espectrometría (Maldi-Tof; ICR-FT/MS) phylogenetic coherence RNAr 16S Genes funcionales (MLSA) Análisis genómicos PARÁMETROS PARA CIRCUNSCRIBIR ESPECIES (no se pueden tomar como valores absolutos)  RNAr 16S ≥ 97%  Hibridación DNA-DNA ≥ 70%  ANI ≥ 94%  MLSA ???  Fenotipo = coherencia en muchos carácteres

7 El gen del RNAr 16S permite reconstruir filogeniasEl RNAr 16S se ha convertido en la molécula de referencia para  reconstruir la genealogía  construir el sistema de clasificación  indentificar diversidad ambiental

8 Se pretende asumir el filotipo como especie basada en 16S RNAr¿qué es una especie? Se pretende asumir el filotipo como especie basada en 16S RNAr one species with genomic and phylogenetic heterogeneity several species with identical or nearly identical 16S rRNA Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus carnosus Staphylococcus condimenti three species RBR % - 16S rRNA % Amycolatopsis thermoflava Amycolatopsis methanolica two species RBR 21% - 16S rRNA 98.8% Proteus vulgaris Rahnella aquatilis Archaea 10% Mycobacterium tuberculosis Pseudomonas stutzeri one species with 7 genomovars ∆Tm °C - 16S rRNA % Pseudomonas aeruginosa one species with 3 genomospecies RBR % - 16S rRNA % Staphylococcus aureus En general dos organismos con <97% identidad pertenecen a especies distintas Lo contrario no es cierto

9 Se pretende asumir el filotipo como especie basada en 16S RNAr¿qué es una especie? Se pretende asumir el filotipo como especie basada en 16S RNAr even extreme cases where a single strain may contain different 16S rRNA genes even below 97% similarity!!!! a good correlation!!! "Thermococcus litoralis" Thermococcus barophilus Haloarcula marismortui Haloferax mediterranei Haloferax denitrificans Natronobacterium tibetense Natronobacterium bangense Bacteria 10% one strain with three 16S rRNA operons with 94% similarity two species RBR 35% - 16S rRNA 95.2% RBR 68% - 16S rRNA 97.3% En general dos organismos con <97% identidad pertenecen a especies distintas Lo contrario no es cierto

10 Identificación de organismos (DNA / RNA) no cultivados ► filotipos de RNAr 16S100% reconditioning 99% 98% 97% Librerías de clones  gran variedad de filotipos  errores en la amplificación  agrupaciones por % identidad  97% por especie?  Filotipos ≠ especies  OPU (operational phylogenetic unit) Se puede determinar a grandes rasgos la identidad de los organismos presentes a Acinas et al., 2004 Nature 430:

11 BASES DE DATOS  S rRNA  > 300 bases  > 900 bases  50% mala calidad  20% buena calidad  5% (10%) cultivados

12 El crecimiento de la base de datos es exponencialBASES DE DATOS  95% de las secuencias son ambientales  5% de las secuencias son de organismos cultivados  1% de las secuencias se corresponden con especies conocidas

13 La calidad de las secuencias aumenta con el tamaño de fragmento secuenciado rojo (secuencias totales)  negro (buena calidad) El gen está conservado de distinta forma en distintos sectores. Las secuencias cortas pierden información relevante Son las más abundates en la base de datos No es recomendable reconstruir filogenias

14 La identidad basada en RNAr 16S ambiental, muy probablemente se limite a filotipos4 filos concentran el 87% de los taxones descritos La mayor parte de origen clínico Yarza et al System Appl Microbiol 31: Identificación de un DNA ambiental  a nivel de especie poco probable  hay 4 grupos que tienen la mayoria de aislados  información metabólica  información genética  otros filos => difícil especular Hugenholz et al AEM 18: Una secuencia no garantiza identificar el metabolismo y genética

15 El concepto de genoma de una especieGenes “auxiliares” no presentes en todos las poblaciones y con poca señal filogenética Genes “core” esenciales y con señal filogenética Genes “específicos” de población y sin señal filogenética Lan and Reeves TRENDS Microbiol 8:

16 Otras moléculas con señal filogenéticaCaracterísticas de una molecula como reloj molecular  universalmente representada  Solo 34 genes ortólogos universales (Huynen & Bork, PNAS, : )  Se pueden seleccionar genes específicos de grupo (e.g. filo) y no universales  constancia funcional  conservación en la secuencia suficiente para la reconstrucción  suficiente complejidad para tener señal filogenética Marcadores que dan soporte a la filogenia global  RNAr 16S  RNAr 23S  EF-Tu (algunos filos son parafiléticos e.g. Actinobacteria y Streptomyces)  RNA polimerasa rpoB (algunos filos parafiléticos e.g. Epsilonproteobacteria y resto Proteobacteria)  Heat Shock Hsp60 (Bacteria: GroEL, Archaea: Tf-55; tambien algunos parafiléticos)  Aminoacyl tRNA sintetasas Marcadores que NO dan soporte a la filogenia global  ATPasas  DNA girasas  Hsp70  RecA De todos modos, si tienen señal a niveles más concretos y pueden dar una idea de la identidad Ludwig and Schleifer Microbial phylogeny and evolution (Sapp) (Oxford University Press)

17 La filogenia de Salinibacter ruberFilogenia con genes funcionales de S. ruber cepa M8 22 ortólogos seleccionados ► Filogenias individuales (ileS, pyrG, rpsC, S5, rpoC, rpoB, gyrB, thrS, mfd, ftsY, tuf, uvrA-2, ffh, glyA, recN, ruvB, recG, rho, groEL, recA, uvrA, valS) 22 secuencias concatenated ► posiciones 74 ortólogos seleccionados automáticamente ► posiciones 3 posibles filogenias Of all 22 analyzed genes:  57 % Bacteroidetes  27 % Chlorobi  18 % Chlorobi- Bacteroidetes Sória-Carrasco et al System Appl Microbiol. 30:

18 De los 29 genes analizados: 31% Chlorobi  38% Bacteroidetes  10% Chlorobi- Bacteroidetes  21% other reconstructions

19 22 genes / 10.757 posiciones 74 genes / 17.149 posicionesÁrboles concatenados:  misma topología que 16S rRNA  resolución similar  confima la divergencia temprana  mayor robustez Mucho más complejo para el mismo resultado 16S ► aproximación más parsimoniosa 22 genes / posiciones 74 genes / posiciones Sória-Carrasco et al System Appl Microbiol. 30:

20 El valor de los análisis multilocus (MLSA)DDH es el estándar para circunscribir especies 50-70% genome similarity Selecciones al azar de 22 genes ► checking branching robustness ► 12 genes give the minimal reliability ► el diseño de cebadores no es siempre fácil DDH será menos preciso pero más parsimonioso MLSA (multilocus sequence analysis)  5-10 secuencias completas/parciales  house keeping genes dificultades en el diseño de cebadores biases en la selección de genes más trabajoso (Stackebrandt et al IJSEM. 52: ) Sória-Carrasco et al System Appl Microbiol. 30:

21 El problema de la pérdida de identidad por transferencia horizontal de genes (HGT)DOS ESCUELAS Las incongruencias filogenéticas hacen pensar en una transferencia horizontal exagerada que desdibuja la filogenia de los organismos Doolittle y otros Las incongruencias filogenéticas Se pueden explicar por ► eventos de duplicaciones (paralogías) y pérdida de genes (hidden paralogy) ► falsa asignación de ortologías ► artefactos en los alineamientos La solución es siendo más estricto en la selección de genes y en la asignación de ortologías Soria-Carrasco & Castresana, Mol. Biol. Evol. 25: Kurland Bioessays 27: Kunin et al Genome Res. 15:

22 McCarren & DeLong, Environ. Microbiol. 9:846-858 (2007)El problema de la pérdida de identidad por transferencia horizontal de genes (HGT) Sensory rhodopsins Bacteriorhodopsins Halorhodopsins Proteorhodopsins Xanthorhodopsins A medida que se van secuenciando DNA ambientales aparecen más y más proteorhodopsinas (hasta en euriarcheotas) que se atribuyen a una enorme tasa de HGT McCarren & DeLong, Environ. Microbiol. 9: (2007) Salinibacter M8 & M31 encode for 4 rhodopsins Si los 3 tipos de proteorhodopsinas se consideraran distintos genes (como el resto), probablemente se hablaría de un ancestro común y no de HGT

23 www.sorcerer2expedition.org 200 l agua de mar2 millones de secuencias (media de 800 bases) 1.2 millones de genes 1400 ≠ 16S rRNA 600 ≠ recA 800 proteorhodopsinas nuevas Venter et al., Science 304:66-74 200 l agua de mar / estación 41 puntos de muestreo 44,000 – 420,000 clones/estación 7,700,000 lecturas total 6,250,000 genes (3,081,849 contigs) 4,125 ≠ 16S rRNA (>5000 recA!) 811 ≠ ribotipos (97%) (50% novel) Alfaproteobacteria (SAR11) más abundante Incremento en información entre ambos estudios   41 muestras   3.9x secuenciaciones   5.1x número de genes   2.9x número de RNAr 16S ≠ Rusch et al., PLoS Biol. 5:

24 La probabilidad de encontrar un gen con señal filogenéticaVenter: Global Ocean Sampling (Rusch et al., PLoS Biol. 5: ) random sequencing  6,250,944 ORFs  6,413 16S ≠ Ξ 0.1% (1/1000)  fósmido ►100 orfs Ξ 10% contendrá un RNAr 16S (o marcador filogenético)  cósmido ►40 orfs Ξ 4% contendrá un RNAr 16S (o marcador filogenético)  Valores semejantes se obtendrán para otros genes con pocos parálogos  Si hay 34 ortólogos universales Ξ 3.5% de los genes (29/1000)  Aumentan mucho las posibilidades de encontrar un gen con señal en un fósmido Asignación por tetranucleótidos (Teeling et al., 2004 Environ Microbiol. 6: ) targeted metagenome libraries si un genoma tiene 4 Mb Ambas aproximaciones concuerdan con una media de genoma de 4Mb La precisión en la identificación depende de lo extensa que sea la base de datos

25 Si el fragmento de metagenoma no contiene marcador filogenéticoSIGNATURAS DEL GENOMA  Contenido G+C ►poco informativo  Codon usage ► equivalente a trinucleotidos ► mayor información  Tetranucleótidos (penta-, hexa-…) ►mayor información, pero mayor coste de cálculo Variaciones de tetranucleótidos: 44 = 256

26 Se puede realizar la regresión de las frecuencias de uso de tetranucleótidosÍndice de regresión  dos genomas semejantes tienen frecuencias semejantes (buena correlación; e.g. 0.89)  dos genomas distintos tienen frecuencias distintas (mala regresión; e.g. 0.45)

27 Probablemente de un mismo genoma u organismoSe puede realizar la regresión de las frecuencias de uso de tetranucleótidos Probablemente de un mismo genoma u organismo En un grupo de clones de metagenoma se puede observar cuáles pueden ser asignados a un mismo genoma o de organismos muy semejantes Teeling et al., 2004 Environ Microbiol. 6:

28 Dos poblaciones de una misma especie pueden no compartir orfsSi los fragmentos de DNA no compartidos tienen una misma frecuencia de uso, se puede hipotetizar una identidad semejante Peña et al., manuscrito en preparación

29 La identidad de un fragmento de DNA si se encuentra un gen codificante para 16S rRNA ► buena precisión > 300,000 secuencias en bases de datos  otros marcadores universales:  23S ► precisión adecuada > 12,506 secuencias en bases de datos  otros genes esenciales ► poco precisa por falta de entradas en bases de datos  otros marcadores no universales:  depende del grupo y la exhaustividad en el estudio ► Proteobacteria vs Acidobacteria  no marcadores ►la signatura de tetranucleótidos puede dar una idea (depende del número de genomas secuenciados)  La identidad depende de haber clasificado anteriormente el organismo; sólo 8000 especies descritas  Una hipótesis sobre genética/metabolismo/ecología depende de los conocimientos previos del grupo (i.e. aislados estudiados, información sobre autoecología…)

30

31 Numbers of total existing species is very controversial Some El problema de la pérdida de identidad por transferencia horizontal de genes (HGT) Numbers of total existing species is very controversial Some Slava Epstein believe <40.000 Others Carles Pedrós-Alió believe >109 And even others Dykhuizen believe >1018 a Pedrós-Alió, 2006 TRENDS Microbiol 14: