1 LA IMPORTANCIA DEL pH EN CULTIVO EMBRIONARIO Empar Ferrer Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid

2 Introducción al pH Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pH es la medida de los iones de hidrógeno La acidez de una solución está determinada por su concentración en iones H+ (expresado en unidades de pH) Concepto de pH Se define pH como el logaritmo decimal del inverso de la [H + ] expresado en equivalentes–gr/litro (N) pH = log 1 / [H + ] o pH = –log [H + ] De esta forma la neutralidad viene indicada por un valor de pH = 7 siendo los valores inferiores de estado ácido y los valores superiores de estado básico.

3 Afecta a numerosos procesos biológicos y bioquímicos : - Reacciones enzimáticas (ej. catalizar reacciones ácido-base, reacciones con grupos amino o carboxilo) - Puentes de hidrógeno (uniones de bases en ácidos nucleicos, estructuras proteicas) - Cambio de grupos polares como grupos carboxilo o amino (ej. estructuras proteicas, interacciones fosfolipídicas de membrana, actividad enzimática) - Producción de ATP quimiosmótico de enzimas respiratorios - Mecanismos transportadores de membrana Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Importancia de la concentración de H+

4 pHi pHe - pHi : intracelular - pHe : extracelular Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Tipos de pH El pHe afecta a los embriones, debido a que impacta en el pHi y se deben gastar recursos celulares para mantener la homeostasis intracelular. Es fundamental mantener estable el pHe durante todos los procesos in vitro, para minimizar el stress y mantener estable el pHi para optimizar el desarrollo embrionario EQUILIBRIO pHi-pHe

5 - Cambios de pH durante 3 h por encima de 7.42 o menos de 6.87: relocalización de las mitocondrias elementos del citoesqueleto, cambio en la localización de los orgánulos, organización de cromosomas y al desarrollo embrionario (Squirell 2001). - Cambios en la actividad glicolítica y al mecanismo oxidativo (Lane & Garner 2000) - Problemas en el patrón de metilación del DNA - Cambios en desarrollo fetal (Zander-Fox, 2010) Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Problemas asociados a un desequilibrio del pH

6 Mecanismos de regulación del pHi Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pHi de las células está controlado por proteínas transportadoras de membrana que bombean iones de H+ o de bicarbonato dentro o fuera de la célula. Hay dos tipos de mecanismos: baja de 7.0 - Sistema antitransportador Na + /H +: si pH baja de 7.0, que protege de la acidosis: introduce Na+ y saca H+. alcanza 7.2-7.3 - HCO 3 - /Cl - transportador: si el pHi alcanza 7.2-7.3 se activa, protege de la alcalosis ; saca HCO3- y entra Cl- En humanos, el pHi normalmente no es igual al pHe, al menos al principio y brevemente, el pHi sigue al pHe. La regulación del phi no empieza hasta que se alcanzan un los valores de activación

7 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid ácido carbónico/bicarbonato. H 2 CO 3 / HCO 3 - El principal sistema de tampón biológico es el ácido carbónico/bicarbonato. H 2 CO 3 / HCO 3 - Los iones bicarbonato participan en procesos: -Tamponamiento, -En la gluconeogenesis -En el metabolismo de los ácidos grasos. -En mecanismos de transmembrana, principalmente en la regulación del pHi. Mecanismos de regulación del pHi Es por esto que los medios de cultivo llevan bicarbonato, para colaborar en la función celular.

8 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pH del medio de cultivo ¿ Cuál es el pH ideal para el cultivo embrionario? El que imite la situación in vivo

9 - Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid https://www.youtube.com/watch?v=6cIGmb82k-w

10 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Swain. 2012 pHi embriones 7.1 - 7.2 El pH del medio de cultivo

11 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pH del medio de cultivo

12 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pH del medio de cultivo

13 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El pH del medio de cultivo Los medios de cultivo pH entre 7.2-7.4 pH recomendados por las casas comerciales Swain. 2012

14 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid ¿Estas diferencias de pH según la casa comercial a qué se deben?

15 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Arginina Fenilanalina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Treonina Triptofano Valina Aminoácidos Alanina Asparagina Cistina Glicina Prolina Serina Tirosina Aspartato Glutamina Taurina Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina (B6) Riboflavina (B2) A.Fòlic (B9) Pantotenat Cálcico (B5) Nicotinamida (B3) i-Inositol (B) Sales/minerales Citrato Cloruro cálcico Cloruro Potásico Cloruro sódico Bicarbonato sódico Fosfato Sulfato magnesio Lactato sódico Piruvato sódico Ortofosfato monosódico Fosfato sódico di-Hidrogeno Glúcidos Glucosa Fructosa Proteínas Albúmina Antibiótico Gentamicina Otros MOPS Hialuronan Agua EDTA Ácido Lipoico Vitrolife Composición del medio: Cantidad de bicarbonato y de la concentración de proteínas

16 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid

17 ¿Cómo podemos conseguir el pH deseado?

18 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid CO 2

19 Ác. carbónico Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Bicarbonato

20 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Ajuste del pH con la concentración de CO2 de los incubadores CO2  pH La concentración de gas se puede dar de formas diferentes: -Comúnmente, hablamos de porcentaje y esto es la concentración relativa ( % total presión atmosférica) -La presión parcial absoluta (mbar o kPa), esta determinaría la concentración del CO2 disuelto El % de presión atmosférica varia según el clima y la altitud

21 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Ajuste del pH con bicarbonato Añadiendo NaHCO 3 a los medios de cultivo se puede modificar el pHe NO RECOMENDABLE

22 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Para mantener el pH de los medios fuera del incubador (sin CO2), se utilizan tampones novolátiles, los más comunes son el HEPES y el MOPS, que afectan mínimamente en la función celular. Estos medios contiene bicarbonato, que permitirá trabajar fuera del incubador por un tiempo limitado. Control del pH fuera del incubador

23 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Control del pH fuera del incubador Ronny Jassens

24 - La composición de los medios ayuda a estabilizar el pHe - Las concentraciones de CO2 y los niveles de bicarbonato influyen en el pHe - Es fundamental mantener siempre el pHe recomendado por las casa comerciales durante todos los procesos del laboratorio, tanto con ovocitos como espermatozoides; en la denudación, microinyección, cultivo, cambiando embriones de placa, biopsiando, congelando…para no afectar al pHi ni la viabilidad del embrión. Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Conclusiones

25 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Aspectos prácticos para las medidas del pH

26 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Medio en tubos “Falcon” Para incubadores clásicos (Heracell) - Con 500-1000 µl de medio Preparación del medio de cultivo Medio en placas de 4 pocillos o 60 mm Para todos los incubadores - 4 Pocillos: Con 400 µl cubiertas de aceite - 60mm: microgotas de 50µl de medio cubiertas de aceite

27 Preparación del medio de cultivo Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid El día anterior El medio requiere horas para equilibrarse Ronny Janssens

28 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Preparación del medio de cultivo El día anterior El medio requiere horas para equilibrarse Swain. 2013

29 pHímetros Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid epoc Analizador de sangre

30 Realización de las medidas el pH Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Rápido -El pHímetro realiza unos procesos con unos tiempos -Si se queda el medio fuera del incubador tiempo, el pH cambiará TENER TODO PREPARADO

31 Realización de las medidas el pH Protocolo Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Preparar pHímetro: -Conectar la “base”-lector y Conectar la pantalla -Poner el ID de usuario y contraseña (1111) Prepara la tarjeta: -Insertar la tarjeta, lectura, calibrado -Poner número identificación de la muestra

32 Realización de las medidas el pH Protocolo Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid - Preparar jeringa y aguja: - Carga del medio en la jeringa : Cuando indique inyectar muestra - Quitar aguja y Purgar la jeringa

33 Realización de las medidas el pH Protocolo Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid - Carga de la muestra al pHímetro: - Valoración del pH y otros parámetros

34 Realización de las medidas el pH Protocolo Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid - Registro de datos:

35 - Tipo de incubador - Condiciones del laboratorio (tª, humedad, altitud) - Tipo de medio (casa comercial) - Volumen y contenedor del medio (tubo o placa) - Presencia de aceite mineral - Tiempo de equilibrado - Tiempo en realizar la medida - Tipo de albúmina Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Factores que influirán en el valor del pH

36 - Todos los incubadores Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Qué medir y con qué frecuencia Empieza el debate - Cada lote -Diariamente, cada semana, tras paradas o cambios importantes…??? - Cada cambio de bala de CO2

37 Reunión de Embriólogos. 15 Enero 2016. Madrid Muchas gracias