1 La reacción de PCR y sus aplicaciones

2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3 PCR: cinética nº ciclos DNA producto primers

4 PCR: diseñando ciclos 92ºC 92ºC 92ºC 72ºC 72ºC 72ºC 55ºC 55ºC 55ºC RTDesnaturalización: Lo mas corto posible Evita inactivación enzima Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos 55ºC 55ºC 55ºC Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers RT

5 PCR: cinética nº ciclos DNA producto primers Enzyme activity

6 DNA polimerasas termoestablesProcesividad: 5’-3’ actividad de síntesis Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa Adición de As

7 Procesividad Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min Pwo polimerasa: 1 Kb/min

8 Fidelidad en la PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Polimerasa3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación Taq polimerasa NO x Pfu polimerasa SI x Pwo polimerasa SI x

9 Adición de As Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO5’ -A3’ 3’A- 5’ Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO Pwo polimerasa: NO -T3’ 3’T- -T A T

10 Optimización de PCR Parametros del ciclo Minimo numero de ciclosLas tres reglas Diseño de oligos Tm’s 55-80ºC No concentrar GC en el extremo 3’ Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM) Demasiado da inespecificidad Poco da poca producción Coadyuvantes BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especificos Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes ricos en GC) DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC Mezcla de polimerasas Hot start

11 Algunas aplicaciones Obtener genes PCR degenerada PCR reversaModificar genes Introducir sitios de restricción Mutagénesis dirigida Mutagénesis al azar

12 PCR degenerada 5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ 5’NTTNCAYGARTCYTT3’ ADRGT YKILPPCR en condiciones poco estrictas Temperatura Mg++ Concentracion de oligos Diseño de los primers: Tamaño minimo (21 mer) Evitar aminoacidos con mas de un tipo de codon No mas de tres G o C seguidas en los ultimos tres nucleotidos PCR con primers en solitario

13 PCR reversa

14 PCR reversa Touch-down PCR Nested touch-down PCR

15 Nested PCR X bp Y bp X bp Y bp Fragmento A: Z pbFragmento B: Z -(X+Y)pb

16 Touch-down PCR 94ºC 60-65ºC

17 Introduciendo sitios de restricción

18 Mutagénesis al azar localizadaRE1 RE2 PCR en condiciones de baja fidelidad Desbalance de nucleotidos Mn ++ en vez de Mg++ Polimerasas mutantes RE1 RE2 RE1 RE2

19 Mutagénesis sitio-específicaRE1 RE2 MUT1 MUT2 RE1 RE2 RE1+MUT1 RE2+MUT2 RE2 RE1