1 La Tecnología de Microarrays en Medicina Reproductiva Dr. José A.Horcajadas - Investigador ARAID - Investigador de la Fundación IVI, Valencia, Spain - Director Científico de iGenomix, Valencia, Spain - Profesor Asociado de la Univ. De Valencia y Pablo de Olavide de Sevilla

2 IMPLANTACIÓN EMBRIONARIA DIÁLOGO MOLECULAR - Un embrión en estadío de blastocisto Receptividad endometrial Para conocer las bases moleculares de la infertilidad Para mejorar los ciclos de estimulación ovárica Seleccionar el mejor embrión % EMBARAZO

3 INTRODUCCIÓN AL ENDOMETRIO HUMANO

4 14 15 16 17 18 19 20 21 Bergh P, Navot D. Fertil Steril 1992; 58: 537-42 VENTANA DE IMPLANTACIÓN CLÍNICA LH+7 LH+0

5 Características del endometrio receptivo receptivo » » Marcadores morfológicos » Marcadores Bioquímicos » Patrones de expresión génica Características del endometrio receptivo receptivo » » Marcadores morfológicos » Marcadores Bioquímicos » Patrones de expresión génica

6 ESTUDIOS HISTOLÓGICOS Psychoyos Ann N Y Acad Sci 86, Murphy et al Cell Biology Int 1994

7 LOS CRITERIOS DE NOYES, 1950 Noyes y cols., Fertil Steril 1950; Noyes y cols., Am J Obstet Gynecol 1975

8 - Li TC, Dockery P, Rogers AW, Cooke ID (1989) How precise is histologic dating of Endometrium using the standard dating criteria. F&S 51:759-63. - Balasch J, Fabregues F et al., (1992) The usefulness of endometrial biopsy for luteal phase evaluation in infertility Hum Reprod 7:973-7. - American Society for Reproductive Medicine (2000) A practice committee report: optimal evaluation of the infertile female ASRM, 2000:1-6. - Murray MJ, Meyer WR, Zaino RJ, Lessey BA, et al., (2004) A critical analysis of the accuracy, reproducibility, and clinical utility of histology endometrial dating in fertile women. Fertil Steril 81:1333-43. -Coutifaris C, Myers ER, et al., (2004) Histological dating of timed endometrial biopsy tissue is not related to fertility status. Fertil Steril 82:456- 61. CRÍTICAS A LOS MÉTODOS HISTOLÓGICOS

9 MARCADORES BIOQUÍMICOS From Giudice et al. Trends Endocrinol Metab, 1995

10 DNA – 30 K genes DESDE EL GENOMA HASTA LA FUNCIÓN mRNA? Proteínas? Hitos Estructura DNA 1953 Código Genético 1961 Proyecto Genoma 1985-2003 Nuevas tecnologías Microarrays 1995 Secuenc. Masiva 2006 Procesos Biológicos Funciones Biológicas Vida/Muerte

11 EL ENFOQUE TRADICIONAL VERSUS EL ENFOQUE GENÓMICO

12 Por primera vez descrita en 1995 (Schena, Science) Basada en la complementariedad de los ácidos nucleicos Permite analizar cientos de eventos en un solo experiemento El impacto en Ciencia. Miles de publicaciones al año TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS

13 GENE EXPRESSION PROFILING OF HUMAN ENDOMETRIAL RECEPTIVITY ON DAYS LH+2 VS LH+7 BY MICROARRAYS EXPERIMENTAL DESIGN MICROARRAY AFFIMETRIX HG-U95A 12,686 genes RNA ISOLATION TWO ENDOMETRIAL BYOPSIES LH+2 LH+7 Riesewijk et al. Molec Human Reprod 9, 253-64, 2003 FIVE WOMEN Caucasian Fertile women with normal cycles 23–39 years body mass index:19-25 kg/m2

14 GENES REGULADOS DURANTE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN Up at LH+7Down at LH+7 Strong (>10)225 Medium (5-10)4712 Weak (3-5)8441 15358 Results (>3.0 fc in 4 out of 5) Riesewijk et al. Molec Human Reprod 9, 253-64, 2003

15 Principal Component Analysis LH+2 and LH+7samples based on2000random genes LH+2 L 7 PCA 1 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 -3000-2000-100001000200030004000 11756 9064 8669 9068 9286 9068 11756 8669 9064 9286

16 GENES DE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN Horcajadas et al. Molec Human Reprod 2005 Horcajadas et al., JCEM 20062003 Horcajadas et al., JCEM 2007 Horcajadas et al., JCEM 2008

17 EXPRESIÓN GÉNICA EN CICLOS NATURALES Y ESTIMULADOS EN LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN EXPERIMENTAL DESIGN FIVE ENDOMETRIAL BYOPSIES AT EACH TIME POINT MICROARRAY AFFIMETRIX HG-133A >22,000 genes 50 WOMEN Caucasian Fertile women with normal cycles 23–39 years body mass index:19-25 kg/m2 LH Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 hCG Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 GeneSpring 7.0 GEPAS HISTOLOGICAL CONTROL: BLIND DATING BY NOYES CRITERIA

18 Day LH/hCG+1 PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH+1/hCG+1

19 Day LH/hCG+3 Day LH+3/hCG+3 PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)

20 Day LH/hCG+5 Day LH+5/hCG+5 PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)

21 Day LH+7/hCG+7 PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)

22 Day LH/hCG+9 Day LH+9/hCG+9 PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)

23 Natural/LH vs IVF across the WOI PRE-RECEPTIVE RECEPTIVE PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)

24 BIOLOGICAL PROCESSES FROM DAY LH+1 TO LH+9 COMPARED TO COS CYCLES

25 1 2 3 1 2 3 GENE CLUSTERING IN NATURAL AND COS CYCLES 34.4% WOI GENES 92%

26 BIOLOGICAL PROCESSES OF THE 203 DELAYED GENES BIOLOGICAL TERMCount%PValue taxis 52,67%0,0437137 cell motility 73,74%0,04103273 blood vessel development 42,14%0,03996548 negative regulation of physiological process 126,42%0,09769689 transport 4121,93%0,02625948 positive regulation of apoptosis 63,21%0,02985379 locomotory behavior 52,67%0,04919509 phosphate metabolism 168,56%0,07933242 negative regulation of biological process 158,02%0,03312411 locomotion 73,74%0,04103273 cell death 115,88%0,09003195 localization of cell 73,74%0,04103273 localization 4825,67%0,00371126 fructose 6-phosphate metabolism 21,07%0,04132375 organic acid metabolism 105,35%0,08394103 carboxylic acid metabolism 105,35%0,08237153 chemotaxis 52,67%0,0437137 behavior 63,21%0,05876496 positive regulation of programmed cell death 63,21%0,03071029 negative regulation of cellular process 136,95%0,07576561 phosphorus metabolism 168,56%0,07933242 negative regulation of cellular physiological 126,42%0,08059537 cellular physiological process 12667,38%0,05501213 development 2714,44%0,0787654 angiogenesis 42,14%0,03590782 vasculature development 42,14%0,03996548 response to stress 1910,16%0,04424593 negative regulation of cell proliferation 52,67%0,080454 death 115,88%0,09312635 response to chemical stimulus 94,81%0,05742527 cell proliferation 136,95%0,01235572 establishment of localization 4725,13%0,00571022 cellular lipid metabolism 105,35%0,07852663 blood vessel morphogenesis 42,14%0,03996548

27 BIOLOGICAL CONECTIONS AMONG THE 203 DELAYED GENES Horcajadas et al., 2008 JCEM

28 Journal of Clinical Endocrinology of Metabolism 2008, 93:4500-4510

29

30 Cómo usar esta información en la clínica?

31 Desde la básica a la clínica

32 APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS - Para la evaluación de la receptividad endometrial

33 New England Journal of Medicine 2006;354:2463-72.

34 Integrando toda esta información para elaborar una herramienta molecular para el dataje endometrial DATOS DE EXPRESIÓN GÉNICA INSTITUTO NACIONAL DE BIOINFORMÁTICA BIOINFORMÁTICA APLICADA A GENÓMICA FUNCIONAL Endometrial Evaluation/Dating Predictor EEP or EDP ERA

35 15k Grupo de prueba: 206 + 28 + 76: 310 genes – 17 genes = 293 genes / 738 sondas Número total de spots:15.744 spots Control Agilent: 536 spots Spots útiles: 15.208 spots 8 replicates = 738 x 8 = 5.904 spots Spots Vacíos= 9.304 8x15K Endometrial Receptivity Array (ERA)

36 Prophet Endometrial Receptivity Array (ERA) Francisco Esteban, Universidad de Jaén

37 Sondas LH+7 LH+2Día 9 desconocidoSondas ¿Cómo trabaja un Predictor?

38 Endometrial Receptivity Array (ERA) Hierarchical clustering R NR

39 Endometrial Receptivity Array (ERA) Gene Ontology Term over-representedGO level% genes Nº genes Gene names per class adjusted P-value inmune response (GO 0006955)BP314.9426 DPP4 OPRK1 C3 CRISP3 HLA-DOB C4BPA NR4A2 XCL2 LIF CXCL14 GZMA XCL1 CXCL13 KLRC1 IL15 INDO CD7 BCL6 SERPING1 CLU CTSW GBP2 PSMB10 DEFB1 CFD ARHGDIB 4,14E-04 response to stress (GO:0006950)BP315.5227 ADRA2A C3 PROS1 AOX1 C4BPA HPSE DUOX1 SOD2 FGB SCYE1 CXCL14 MAP2K6 RAD54B THBD CXCL13 BARD1 IDH1 ANG BCL6 GPX3 GADD45A SERPING1 CLU PPARGC1A PENK CFD CDC2 9,49E-03 defense response (GO:0006952)BP310.3418 C3 AOX1 CRISP3 C4BPA HPSE SCYE1 CXCL14 GNLY CXCL13 IL15 CD7 BCL6 SERPING1 CLU OFD1 DEFB1 PENK CFD 9,76E-03 circulation (GO:0008015)BP34.608EDNRB FGB XCL2 CYP2J2 S100A1 SERPING1 EDN3 TH9,76E-03 response to external stimulus (GO:0009605)BP310.3418 C4BPA HPSE FGB XCL2 SCYE1 CXCL14 THBD XCL1 CXCL13 BCL6 SERPING1 CLU PPARGC1A DEFB1 CFD C3 PROS1 AOX1 9,76E-03 behavior (GO:0007610)BP36.3211OPRK1 XCL2 SCYE1 CXCL14 XCL1 CXCL13 MAOA TRH TH DEFB1 PENK3,36E-02 cell cycle (GO:0007049)BP312.0721 HRASLS3 RASSF2 MAP2K6 RAD54B CCNB2 GAS1 PBK BARD1 G0S2 HPGD KIF11 PRC1 ASPM GADD45A IGF2 RPRM DLG7 CORO1A BUB1B CDC2 CDC20 3,59E-02 cell adhesion (GO:0007155)BP310.3418 CRISP3 MUC16 HABP2 CTNNA2 CLDN10 EMCN BCL6 CLDN4 VCAM1 COBL COMP AMIGO2 THBS2 POSTN SPP1 LAMB3 COL16A1 ARHGDIB 4,18E-02 anatomical structure development (GO:0048856) BP32.4139 POSTN ID4 EVC OLFM1 SPP1 EDN3 LAMB3 TH CRABP2 NR4A2 NDRG2 DUOX1 EDNRB ALPL EFNA1 IGFBP1 CDA TAGLN LIF HAND2 ADAMTS1 PRKCQ CTNNA2 ENPEP CXCL13 DKK1 LRP4 ANG HEY2 IER3 IL15 EMCN BCL6 CSRP2 HEY1 COBL COMP IGF2 MSX1 4,52E-02 humoral immune response (GO:0006959)BP46.0210C3 C4BPA NR4A2 XCL1 KLRC1 SERPING1 CLU PSMB10 DEFB1 CFD7,06E-03 cell-cell signaling (GO:0007267)BP413.2522 OPRK1 SLC1A1 HSD11B2 NR4A2 GDF15 EFNA1 XCL2 SCYE1 LIF CXCL14 XCL1 ENPEP CXCL13 NRG2 MAOA TRH IL15 GABARAPL1 DLG7 EDN3 TH PENK 7,06E-03 innate immune response (GO:0045087)BP44.227SERPING1 CLU DEFB1 CFD C3 CRISP3 C4BPA7,90E-03 mitotic cell cycle (GO:0000278)BP46.6311DLG7 CORO1A BUB1B CDC2 CDC20 CCNB2 GAS1 PBK KIF11 PRC1 ASPM2,99E-02 response to wounding (GO:0009611)BP48.4314C4BPA HPSE FGB SCYE1 CXCL14 THBD CXCL13 BCL6 SERPING1 CLU CFD C3 PROS1 AOX13,17E-02 oxidoreductase activity (GO:0016491)MF318.1021 CBR3 SORD SOD2 IDH1 MAOA KMO CYP2J2 ACADSB INDO HSD11B2 LEPREL1 LAMB3 AOX1 TH CYBRD1 GPX3 HPGD DHRS3 CYP3A5 CP DUOX1 4,49E-02 carbohydrate binding (GO:0030246)MF39.4811ADAMTS1 EMCN FAM59A THBD GALNT12 SERPINA5 HABP2 KLRC1 THBS2 ANG POSTN4,62E-02 receptor binding (GO:0005102)MF416.9123 FGB EFNA1 XCL2 SCYE1 IGF2 ANG CXCL14 LIF TRH C3 ADAMTS1 EDN3 SPP1 PPARGC1A XCL1GABARAPL1 GDF15 CXCL13 GREM2 NRG2 PENK GAST DKK1 1,52E-02 spindle (GO:0005819)CC1030.437CDC2 CDC20 KIF11 PRC1 KIF4A DLG7 BUB1B9,47E-05 spindle microtubule (GO:0005876)CC1130.774CDC2 KIF11 PRC1 KIF4A7,29E-04

40 Endometrial Receptivity Array (ERA) Gene clustering

41 Endometrial Receptivity Array (ERA) Transcriptomic Signature

42 Endometrial Receptivity Array (ERA) Comparison with Histology

43 FARMACOGENÓMICA FARMACOGENÓMICA EN CICLOS DE ESTIMULACIÓN OVÁRICA

44 Ciclos de estimulación ovárica FARMACOGENÓMICA Bajas respondedorasAltas respondedorasNormo respondedoras

45 OBJETIVO Nuestra propuesta Una herramienta predictora del tipo de respuesta frente a los ciclos de estimulación ovárica Detectar marcadores COMO?  Buscar marcadores e incluirlos en una plataforma diagnóstica

46 MUESTRAS Extracción de sangre (3ml en EDTA) Altas-respondedoras n=12 Normo- respondedoras n=12 CONTROLES Bajas-respondedoras n=12

47 MARCADORES Búsqueda de marcadores 1) Detección alteraciones cromosómicas – Array CGH 2) Detección Polimorfismos – Array SNP 3) Detección mutaciones puntuales en receptores – Secuenciación 4) Analizar variantes de genes metabolismo fármacos - Luminex DISEÑO SONDAS PARA LUMINEX

48 ProbeNameGeneNameLogRat io Samples AK130020chr01:17104345-17104404-0.50FCG-11, FCG-13, FCG-16 chr1:191109994- 191110053 chr01:191109994-1911100530.78FCG-14, FCG-16 NEK7chr01:196555302-1965553610.61FCG-11 chr2:131034084- 131034143 chr02:131034084-1310341430.86FCG-16 SATB2chr02:200020740-2000207990.75FCG-16 STK36chr02:219251485-2192515440.95FCG-15 C3orf21chr03:196270291-1962703501.17FCG-14 KIAA1680chr04:92154164-921542230.72FCG-11 chr5:97077666-97077725chr05:97077666-970777251.89FCG-12 XRCC2chr07:151982740-1519827990.43FCG-11 chr7:152087566- 152087619 chr07:152087566-152087619-0.56FCG-14 sep-07chr07:35886791-358868500.55FCG-14 chr9:115462447- 115462506 chr09:115462447-1154625061.08FCG-16 RNF38chr09:36353448-363535070.98FCG-12, FCG-13, FCDG-15, FCG- 16 ENST00000380027chr11:5762182-57622411.22FCG-12 SLCO1B3chr12:20859893-208599521.93FCG-16 chr13:97329413-97329468 1.25FCG-13 chr14:40704122-40704181 1.27FCG-11, FCG-15 chr16:58439142-58439201 0.65FCG-14 HCRTchr17:37589590-37589637-0.64FCG-14 CLPTM1chr19:50174693-501747520.79FCG-12 NPAS1chr19:52220223-522202820.99FCG-13 AK024373chr19:737550-7376090.76FCG-15 OSBPL2chr20:60247696-602477550.51FCG-16 chr21:22717037-22717096 0.81FCG-15 AK093119chr21:28368917-28368976-0.63FCG-15, FCG-16 GSTT1chr22:22712211-227122661.58FCG-11, FCG-13 Genes comunes Lista de genes con una sonda alterada en ambas comparaciones (muestra con Cy-3 y control con Cy- 5 y viceversa). El color de la muestra significa: verde= cambio en un sentido; rojo= cambio en el otro sentido) SITUACIÓN ACTUAL

49 Las –ómicas en Medicina Reproductiva Transcriptome Proteome Metabolite profiling Pathway identification Genomic Preimplantational Genetic Diagnose Pharmacogenomic POF, IF, Repeated Miscarriage GENOMIC Endometrial Evaluation Preimplantational Genetic Diagnose Endometrial disease Gene Expression markers in blood Sperm analysis for IVF or AI TRANSCRIPTOMIC Endometrial evaluation Embryo selection PROTEOMIC METABOLOMIC

50 C. Simón A. Pellicer

51

52 Thank you for your attention [email protected] [email protected]