1 LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDADDra Susana Elgueta Miranda

2 RESPUESTA INMUNE El sistema inmunológico está programado para:Diferenciar entre lo propio y lo extraño Defensa contra agentes externos Las Moléculas responsables de estos eventos, pertenecen al MHC

3 LEUCOCITOS PASAJEROS

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5 ALORECONOCIMIENTO RESPUESTA MUY VIGOROSA % DE LT RESPONDEN A ALOANTIGENO CLONES RESTRINGIDOS POR MHC PRESENTAN ALOREACTIVIDAD PORCION TCR INVOLUCRADO EN RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC RECONOCE ALOANTIGENO

6 RESPUESTA A ALOANTIGENOSGRAN EXPRESION MOLECULAS CMH, RECONOCIMIENTO DIRECTO POR REACCION CRUZADA, ESTIMULA CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD RESPUESTA POLICLONAL Y POLIESPECIFICA

7 FUNCIONES LABORATORIO ISPLaboratorio Nacional y de Referencia: *Estudio de histocompatibilidad a Receptores (potenciales) y Donantes *Asignación de riñón de donante cadáver *Tipificación HLA en enfermedades: B27, DR Lleva la Lista Nacional de Receptores de Organos (en espera y trasplantados) Otros: PEEC B27, Capacitación etc

8 BARRERAS ANTIGENICAS EN TRASPLANTE DE ORGANOSGrupo sanguíneo ABO Antígenos del CMH (HLA) Antígenos de Complejos Menores de Histocompatibilidad Requerimientos variables según órgano o tejido

9 OTROS ALOANTIGENOS LEWIS ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR MICA / MICB(MICC, MICD, MICE son pseudogenes ) VIMENTINA

10 REQUERIMIENTOS DE HISTOCOMPATIBILIDADHIGADO CORAZON RIÑON MEDULA OSEA

11 LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDADANTIGENOS ANTICUERPOS

12 Estudios RECEPTOR DONANTE RECEPTOR/DONANTE Tipificación HLAExistencia de anticuerpos anti-HLA (panel de anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante Detección de la aparición de anticuerpos anti-HLA post-transplante DONANTE Tipificación de HLA RECEPTOR/DONANTE Prueba cruzada (crossmatch XM) Que es un paciente que tiene un reaccione contra mas de 50% del panel Responderdores que tiene un reaccione entre 1-49% del panel Y no respondeores que no tiene reaccione contra el panel, que no han formado anticuerpos.

13 EFECTO HLA EN TRASPLANTE RENALSOBREVIDA INJERTO FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS GRADO INMUNOSUPRESION DISMINUYE RIESGO DE SENSIBILIZACION (IMPACTO ECONOMICO) Donante vivo/ donante cadavérico

14 HERENCIA CMH A1 B5 DR8 A2 B8 DR3 A9 B12 DR2 A3 B16 DR4 a b c dac, ad , bc, bd HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2 A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4 A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2 A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4 25% idénticos 25% 0 match 50% semiidenticos

15 Tipificación de HLA Métodos serológicos: Métodos moleculares:CDC: citotoxicidad dependiente de complemento Métodos moleculares: PCR-SSP (iniciadores secuencia- específicos) PCR-SSO (sondas secuencia-específicas)

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17 Métodos serológicos Identificacion AntigenosPlacas con antisueros especificos (a-HLA A2, A3, B5, B7 etc) Celulas con antigenos a identificar Pesquisa de Anticuerpos Suero para determinar existencia anticuerpos Células con Antigenos conocidos

18 Tipificación: Métodos serológicos2 x 106/ml lymphocytes Rabbit Complement 30 minutes incubation 1 hour incubation Dispense 1 l of T or B lymphocytes Dispense 5 l of Class I or II rabbit complement Dispense 10 l of Stain-Fix™ or 5 l of Fluoroquench™ Evaluation and Reporting

19 Tipificación: Métodos serológicos“1” Reaction 0–10% Dead Cells “2” Reaction 11–20% Dead Cells “4” Reaction 21–50% Dead Cells “6” Reaction 51–80% Dead Cells “8” Reaction 81–100% Dead Cells

20 TECNICAS MOLECULARES BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA SEROLOGIA kits CTS Biotest One Lambda RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR GRUPOS DE ALELOS ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS Y SUS VARIANTES

21 Micro SSPTM Procedimiento2. Agregar 10 ul de la solucion que contiene el DNA/mezcla-D a cada uno de los pozos de la micro-placa del SSP, con excepción del pocillos que es el control negativo. 1. Agregar Amplitaq de Perkin-Elmer y la muestra de DNA en el tubo de D-Mix 4. Transferir el producto de la reacción de PCR en un gel. 3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)

22 Micro SSPTM Procedimiento1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5. Correr la electroforesis. 6. Analizar los patrones de bandeo y asignar los alelos correspondientes. 7. Interpretación

23 TIPIFICACION HLA-A,B,DRTipificación Serológíca Antígeno A28 B DR5 Subtipos A68 B DR11 Tipificación Molecular Baja resolución A* B* DRB1*11 Intermedia A*6801/ B*4001/4006 DRB1*1101/1104/1106 Alta resolución A* B* DRB1*1104

24 MATCH O COMPATIBILIDADANTIGENOS PRESENTES EN EL RECEPTOR Y EN EL DONANTE MISMATCH O INCOMPATIBILIDAD ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE Y AUSENTES EN EL RECEPTOR

25 EJEMPLO HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADREHLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5 HERMANO

26 EJEMPLO R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6 MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8 HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8 HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6

27 COMPATIBILIDAD (MATCH) E INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH)RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ; DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3 DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3 DONANTE MATCH : 1A 1B 2DR MM : 1A 0B 0DR DONANTE MATCH : 1A 1B 1DR MM : 1A 0B 0DR

28 UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1. UN EJEMPLO (1)CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1* PACIENTE , , , - HERM. A , , , - HERM. B , , , - MADRE , , , - PADRE , , , -

29 UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1. UN EJEMPLO (2)CLASE II POR SSP ALTA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1* PACIENTE , , , 0407 HERM. A , , , 0407 HERM. B , , , 0407 MADRE , , , 0405 PADRE , , , 0407

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31 Antigenos y alelos

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33 Antigenos y alelos HLA-DR HLA-DR

34 COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTORMEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL MATCH HLA ES BENEFICIOSO

35 INMUNOGENICIDAD HLA MM PERMITIDOS MM PROHIBIDOS B7 en RECEPTOR A1FENOTIPO RECEPTOR DR6: a-A10, A11, A19, B35 OTROS : Cw, DQ, DP

36 SENSIBILIZACION PRESENCIA DE ANTICUERPOS ALOREACTIVOS

37 CONSECUENCIAS DE LA SENSIBILIZACIONMenor posibilidad de trasplante (XM positivo) Mayor tiempo en lista de espera Sobrevida menor del injerto renal HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)

38 ANTICUERPOS ANTI-HLA RECHAZO HIPERAGUDO DEL INJERTORECHAZO AGUDO HUMORAL DAÑO CRONICO DEL INJERTO

39 CADA MOLECULA HLA PUEDE TENER MUCHOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DIFERENTES

40 ANTICUERPOS ANTI-HLA ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS T DEPENDIENTESRESPUESTA PRIMARIA IgM RESPUESTA SECUNDARIA IgG PRODUCCION DE CELULAS DE MEMORIA

41 VIAS DE SENSIBILIZACIONEMBARAZOS TRANSFUSIONES TRASPLANTES (ANTICUERPOS NATURALES)

42 Detección de anticuerpos anti-HLA y especificidadMetodología CDC ELISA Citometria de flujo Detección por luminex (LABSCREEN®)

43 Detección de anticuerpos anti-HLA por CDCPanel de células (congeladas) PRA ( panel reactive antibody) Paneles diseñados para asegurar una cobertura máxima de antígenos Porcentaje de anticuerpos a-HLA 0% %

44 Detección de anticuerpos anti-HLA por ELISAAnfígenos son purificadas de líneas de células transformado por EBV. Detección de IgG o IgM – depende en el anticuerpo secundario que usan. Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación de especificidad de los anticuerpos.

45 Detección de anticuerpos anti-HLA por FlowPRA™Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo. Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación de especificidad de los anticuerpos.

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47 Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-HLAMayor sensibilidad FlowPRA ELISA CDC Menor sensibilidad

48 CROSSMATCH (PRUEBA DE REACCION CRUZADA XM)Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el suero del receptor, contra los antígenos del donante DISTINTOS METODOS: CDC: distintas células, tiempos de incubación, lavados, etc. CITOMETRIA FLUJO: mayor sensibilidad

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50 IMPORTANCIA DE XM POSITIVODEFINIR ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

51 SENSIBILIZACION Y TRASPLANTE RENALANTICUERPOS anti-HLA ANTICUERPOS anti-NO HLA • ANTIGENOS MENORES DE HISTOCOMPATIBILIDAD • AUTOANTICUERPOS

52 XM (+) CONTRAINDICACION Tx XM (- ) BAJO RIESGOANTIGUO ESCENARIO XM (+) CONTRAINDICACION Tx XM (- ) BAJO RIESGO CAMBIO DE CONCEPTO

53 ANTICUERPOS Y CROSSMATCHANTICUERPOS (–) XM (–) ANTICUERPOS (–) XM (+) ANTICUERPOS (+) XM (+) ANTICUERPOS (+) XM (–)

54 DEFINIR RIESGO TOMA DE DECISION FRACASO EXITO

55 Risk assessment for antibody-mediated rejection Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies Contra High risk Intermediate Low risk indicated Current positive Cytotoxicity Flow cytometry Historical positive Current and historical negative Transplantation 2004, 78(2): 186

56 TIPOS DE DONANTES DONANTE VIVO DONANTE CADAVERICO

57 ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTEMINSAL FONASA HISTOCOMPATI- BILIDAD. I.S.P. Estudio DC Selección R LAB. VALDIVIA Regional CENTROS CENTROS TRASPLANTES PROCURA CORPORACION TX Pesquisa, procuramiento Coordinación

58 HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTESLISTA ESPERA D.CADAVER ABO ABO HLA-A,B,DR HLA-A,B,DR PRA ESPECIFICIDAD XM LT-LB

59 RELACION INJERTO/RECEPTORHUESPED RECHAZA INJERTO INJERTO RECHAZA HUESPED TOLERANCIA INMUNOSUPRESION

60 ¡ G R A C I A S !