1 Laboratorio Virtual Calidad Microbiológica de las Aguas

2 Laboratorio Virtual: Calidad Microbiológica de las AguasAgentes Infecciosos Los afluentes de aguas residuales constituyen la principal fuente de contaminación fecal de los ecosistemas acuáticos. Además de los daños que estos vertimientos producen desde el punto de vista ecológico en estos ecosistemas la calidad microbiológica del agua es de suma importancia para la salud pública, específicamente en países en vías de desarrollo donde el consumo de agua contaminada es una de las principales causas de mortalidad en la población. Calidad microbiológica se define como los posibles usos del agua sin que estos constituyan daños a la salud, lo cual incluye el agua potable para tomar, así como las aguas de uso recreativo, de baño e irrigación. El empleo de bacterias indicadoras de contaminación fecal es un método aceptado universalmente en la vigilancia y evaluación de la calidad microbiológica de los sistemas acuáticos. Entre las bacterias más utilizadas con estos fines se encuentran, los coliformes totales y fecales. Indicadores Microbiológicos Métodos de Detección Métodos Novedosos Técnica Operatoria Preguntas y Respuestas Bibliografía Salir

3 Principales enfermedades transmitidas a través del agua por agentes infecciososAgente Causal Bacterias Fiebre Tifoidea Salmonella typhi Shigelosis Shigella spp. Salmonelosis Salmonella paratyphi Gastroenteritis Escherichia coli Campilobacter spp. Cólera Vibrio cholerae Virus Hepatitis infecciosa Hepatitis A virus Poliomelitis Poliovirus Diarrea Norwalk virus Rotavirus Adenovirus Protozoos Disentería Entamoeba histolytica Giardiasis Giardia lambia Criptosporidiosis Cryptosporidium Etiología desconocida

4 Indicadores MicrobiológicosLos indicadores son organismos asociados con el tracto intestinal, cuya presencia en el agua indica que la misma ha recibido contaminación de origen intestinal. Características Principales Indicadores Microbiológicos

5 Características de los Indicadores MicrobiológicosEstar ausentes en aguas no contaminadas y presentes en aguas contaminadas, cuando la fuente de microoganismos patógenos está presente. No deben multiplicarse en el ambiente. Estar en mayor número que los microorganismos patógenos Responder a las condiciones de ambiente natural y a los procesos de tratamiento de manera similar que los microorganismos patógenos. Fáciles de aislar, identificar y enumerar por métodos convencionales. Incrementar su número al aumentar el grado de contaminación en el medio. Mayor y más predecible el tiempo de supervivencia que los patógenos. Aplicables a cualquier tipo de agua Las pruebas para su determinación deben ser baratas.

6 Principales Indicadores Microbiológicos utilizados en agua.Coliformes totales Coliformes fecales Enterococos Clostridium sulfito reductores Bacteriófagos (contaminación viral) El empleo de bacterias indicadoras de contaminación fecal es un método aceptado universalmente en la vigilancia y evaluación de la calidad microbiológica de los sistemas acuáticos. El indicador más ampliamente usado es el grupo Coliforme. Coliformes totales Coliformes fecales

7 Coliformes Totales Enterobacteriaceae EnterobacteriasSon miembros de la familia Enterobacteriaceae ,son lactosa-positivos y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Incluye gran variedad de organismos, principalmente de origen intestinal. En la práctica, los coliformes son casi todos miembros de las Enterobacterias , desde Escherichia coli, muy común en el intestino, hasta Klebsiella pneumoniae, menos común. La definición incluye además organismos como Enterobacter aerogenes que no está asociado generalmente al intestino. Generalmente los géneros considerados son Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter y Escherichia. Se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un período de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. Es importante tener en cuenta los patógenos provenientes de animales de sangre caliente porque muchos de ellos (por ejemplo Salmonella, Leptospira) infectan también a humanos. Aunque todos los coliformes no provienen de las heces fecales, el conteo total de coliformes es usado como un índice de contaminación de aguas residuales. Enterobacteriaceae Enterobacterias

8 Familia Enterobacteriaceae Los géneros que conforman esta familia son:Leminorella Moellerella Morganella Obesumbacterium Plagia Proteus Providencia Rhanella Salmonella Serratia Tartumella Xenorhabdus Yersinia Budvica Buttiauxella Cedecea Citrobacter Edwardsiella Enterobacter Escherichia-Shigella Ewingella Hafnia Klebsiella Kluyvera Koserella Leclercia Muchas especies tienen como hábitat el intestino del hombre y los animales, mientras que otras pueden parasitar plantas o tener vida saprofítica.

9 Características de EnterobacteriasBacilos Gram Negativos, no esporulados. Móviles, excepto Shiguella y Klebsiella. Fermentan la glucosa. Aerobios facultativos. Necesitan de 18 a 24 horas de incubación para su crecimiento. Catalasa positivo. Oxidasa negativo. Reducen nitratos a nitritos. Habitan en el intestino delgado del hombre como microbiota normal Frecuentemente causan infecciones intrahospitalaria. Localizaciones mas frecuentes de las infecciones: Sistema Nervioso Central, Tracto Respiratorio Inferior, Sangre, Tracto Gastrointestinal y Tracto Urinario. Foto

10 Enterobacterias

11 Cultivo de EnterobacteriasForman colonias circulares, convexas y lisas; con bordes definidos. Presentan, por lo general, muy pocos requerimientos nutricionales y son capaces de sobrevivir en medios relativamente simple. El cultivo en medio diferenciales que contienen colorantes especiales y carbohidratos, (medio Mac Conkey o medio desoxicolato) distingue entre las colonias que fermentan la lactosa (adoptan color) y las que no la fermentan (no se pigmentan) y pueden permitir la identificación presuntiva rápida de las bacterias intestinales.

12 Coliformes Fecales Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los coliformes fecales, que son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. La abundancia de Escherichia coli en los ecosistemas acuáticos ha sido más asociada al riesgo sanitario producto de la contaminación fecal que otros coliformes.

13 Métodos de Detección TradicionalesDurante el proceso de monitoreo de la calidad de las aguas los coliformes son detectados y cuantificados a través de: Técnica de Fermentación en Tubos Múltiples. Técnica de Filtración en Membrana Desventajas de los métodos tradicionales Para Coliformes Totales Para Coliformes Fecales Ver Ver

14 Técnica de fermentación en tubos múltiplesObservación de producción de gas, formación de ácido o abundante crecimiento Técnica de fermentación en tubos múltiples Inocular una serie de tubos de caldo lactosado o lauryl triptosa con diluciones decimales aproximadas de la muestra de agua. Diagrama de flujo 48 h de incubación a 35C 48 h de incubación a 35C Siembra en lactosa bilis verde brillante Observación de producción de gas Prueba Confirmativa de coliformes totales

15 Técnica de fermentación en tubos múltiplesInocular una serie de tubos de caldo lactosado o lauryl triptosa con diluciones decimales aproximadas de la muestra de agua. Observación de producción de gas, formación de ácido o abundante crecimiento 48 h de incubación a 35C Diagrama de flujo Prueba Confirmativa de coliformes fecales Siembra en medio EC 24 h de incubación a 44.5 C Observación de producción de gas

16 Técnica de Filtración en MembranaEl número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Después se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica, la técnica de filtración de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el método de tubos múltiples en menor tiempo. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, también se utiliza en el análisis de leche y otros alimentos líquidos. Diagrama de Flujo Filtros de Membrana Aparato de Filtración Volumen de Agua Analizada Medios de Cultivos Cromogénicos y Fluorogénicos

17 Diagrama de Flujo Técnica de filtración por membranaFiltración de la muestra de agua a través de un filtro estéril con un poro de talla 0,45m Colocar el filtro en un medio selectivo (Medio m – Endo - type y Tergitol TTC) Enumeración de colonias rojas con brillo metálico en medio Endo - type o colonias amarillo naranja en medio Tergitol TTC (incubación 24 h a 35C en medio m – Endo - type para coliformes totales) o (incubación 24 y 48 h a 37 y 44 C para coliformes totales y fecales, respectivamente en Tergitol TTC) Ver Ver

18 Filtros de Membrana Son filtros de superficie, que muestran una estructura microporosa precisa. Durante la filtración las partículas mayores que los poros de la membrana son retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las partículas más pequeñas pueden pasar el filtro. Por lo general, los filtros están compuestos de ésteres de celulosa, con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra.

19 Aparatos de FiltraciónConsiste en un disco incrustado (portafiltros) sostenido por soporte de goma o caucho y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado o una rampa múltiple de filtración. El disco incrustado o perforado (portafiltros) sostiene el filtro de membrana. El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtración bien sea único o colector múltiple (rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de vacío. Ver

20 El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtración bien sea único o colector múltiple (rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de vacío.

21 Volumen de Agua AnalizadaEl volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiéndolas al embudo de filtración. Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo ml de solución tamponada estéril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar. Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución tamponada estéril.

22 Medio Caldo Endo Se utiliza para el recuento de coliformes totales, contiene lauril sulfato y desoxicolato que permiten crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhiben el crecimiento del resto de bacterias acompañantes. Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico. Es usado para la identificación y recuento de coliformes en agua, leche y otros líquidos mediante filtración sobre membrana y esta incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004”. Medio sólido selectivo, que se prepara en placas para filtración de membrana. Medio líquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan una almohadilla absorbente.

23 Medio Agar Lactosa Tergitol-TTCLa degradación de la lactosa en medio Tergitol-TTC, se indica mediante el indicador de pH presente en el medio (bromotimol azul), que provoca que el color del medio cambie bajo la membrana de color verde a amarillo. La selectividad de este medio esta dada por la presencia de heptadecilsusato (Tergitol 7) y 2,3,5 Cloruro de Trifeniltetrazolio (TTC) que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas. El TTC forma parte además del sistema diferencial, su reducción por parte de las bacterias lactosa-negativas produce colonias rojas oscuras en el medio mientras que Escherichia coli y las bacterias coliformes reducen este compuesto rápidamente y hacen que las colonias tomen un color amarillo-naranja. Fotos

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25 CRECIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN MEDIO AGAR LACTOSA TTC CON TERGITOL Son positivas las colonias amarillo-naranja con halo amarillo visible por debajo de la membrana. Ocurre cambio de coloración del medio (verde-amarillo), lo que indica una fermentación de la lactosa con producción de ácido

26 Medios de cultivos cromogénicos y fluorogénicos empleados en la técnica de Filtración en MembranaColiformes E. coli Fluorocult Agar (Merck) - MUG (4-metilumbeliferil-B-D-glucuronido ) y las Colonias con fluorescencia azul Chromocult Agar (Merck) SalmónGal (6-bromo-3-indolyl-B-D-galactopiranosido) Colonias rojas XGLUC ( 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-B-D-glucuronido ) Colonias azul violetas Rapid E coli 2 (Bio rad) XGAL(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-B-D-galactopiranosido) Colonias azules SalmónGlu (6-bromo-3-indolyl-B-D-glucuronido) Colonias púrpuras

27 Desventajas de los métodos tradicionalesAmbos métodos son muy laboriosos. Tiempo de duración de la incubación. Interferencia de organismos antagónicos. Falta de especificidad para el grupo de coliformes. Bajo o débil nivel de detección de coliformes estresados o con lento crecimiento. Necesitan subcultivos adicionales para la confirmación de los resultados.

28 Ventajas y DesventajasMétodos novedosos aplicados actualmente en la detección y enumeración de coliformes en aguas. Métodos enzimáticos Hibridación Fluorescente in situ Reacción en cadena de la polimerasa Métodos inmunológicos (ELISA) GALase GLUase Ventajas y Desventajas Ver Ver Ver

29 Método enzimático para análisis de aguaEnsayo de β-D-galactosidasa(GALase) Filtración de la muestra de agua a través de filtros policarbonatados de poros de 0,2 µm. Poner los filtros en erlenmeyers estériles de 200 mL con 20 mL de buffer fosfato estéril pH 7,2 y 10 mg de sodium dodecyl sulphate. Añadir 10 mg del sustrato fluorogénico MUGal. Incubar en baño de agua agitado a 37°c. Cada 5 min por 25 min, alícuotas de 2,9 mL de los 20 mL se añaden en celdas de Quarzo con 100 µl de solución de NaOH a 1mol/L para obtener pH > 10. Medir la intensidad fluorescente con espectrofluorómetro a una λ de exitación de 362nm y una λ de emisión de 445nm. Cálculo de la concentración de MUF, ploteando en una curva previamente construida.

30 Ensayo de β-D-glucoronidasa (GLUase)Método enzimático para análisis de agua Ensayo de β-D-glucoronidasa (GLUase) Filtración de la muestra de agua a través de filtros policarbonatados de poros de 0,2 µm. Poner los filtros en erlenmeyers estériles de 200 mL con 17 mL de buffer fosfato estéril pH 6,9 y 10 mg de sodium dodecyl sulphate. Añadir 10 mg del sustrato fluorogénico MUGal. Incubar en baño de agua agitado a 44°c. Cada 5 min por 25 min, alícuotas de 2,9 mL de los 20 mL se añaden en celdas de Quarzo con 100 µl de solución de NaOH Medir la intensidad fluorescente con espectrofluorómetro a una λ de excitación de 362nm y una λ de emisión de 445nm. Cálculo de la concentración de MUF, ploteando en una curva previamente construida.

31 Ventajas y desventajas de métodos enzimáticosMayor especificidad Mayor sensibilidad Son más rápidos que los convencionales No requieren de cultivo ni de pruebas confirmativas Desventajas: Son muy costosos Requieren de infraestructura y personal especializado para su ejecución

32 Hibridación Fluorescente in situPrincipio del conteo directo de viables (DVC)-Hibridación fluorescente in situ (FISH) DVC: Las bacterias retenidas en un filtro son embebidas en un medio de revificación que contiene los antibióticos acido nalidíxico y Ciprofloxacina que impiden la división celular. Esto permite contar las células elongadas que son las consideradas como células viables. FISH: Las células elongadas son hibridizadas con una mezcla de hibridización que incluye dos sondas: (1)16 S rRNA llamada “Colinsitu” y que es específica de E. Coli y que esta marcada con un marcador llamado Cy3. (2) EUB 338, 16S rRNA, específica de Eubacterias, marcada con FITC. Fotos

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35 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)Replicación de fragmentos de ADN marcados y específicos de Escherichia coli por la taq polimerasa mediante ciclos de replicación Primers basados en el gen lac Z ya que el producto de este gen es la enzima β-D-galactosidasa. Estudios con esta técnica han permitido la detección de una bacteria coliforme total en 100 mL de agua.

36 ELISA Ensayos de ELISA directos (el anticuerpo es directamente conjugado con el fluorocromo) e indirectos (unión a un anticuerpo específico primario al antígeno marcado, seguido de la adición del segundo anticuerpo marcado con el fluorocromo contra el primer anticuerpo). Estudios comparativos entre ensayos de inmunofluorescencia y filtración en membrana, permitieron obtener resultados superiores en dos ordenes de magnitud mediante el uso de la inmunofluorescencia.

37 Interpretación de los resultadosTécnica Operatoria El método a utilizar será la siembra directa en placa Petri con medio sólido selectivo para coliformes totales y E. coli. Medios de Cultivo Procedimiento Interpretación de los resultados

38 Medios de cultivo Agar Lactosa TTC con Tergitol (Merck) selectivo para coliformes totales y coliformes fecales. Chromocult Agar (Merck). Selectivo para coliformes y E. coli. Rapid E. coli (Bio Rad). Selectivo para coliformes y E. coli. Fluorocult ECD Agar (Merck). Selectivo para E. coli .

39 Procedimiento Hacer las diluciones correspondientes de la muestra con agua destilada estéril en caso de ser necesario (Muestras de aguas residuales o de ríos con elevada contaminación). Tomar 100 µL de la dilución seleccionada de cada muestra e inocular las placas y posteriormente extender los microorganismos con ayuda de la espátula de Drigalski. Incubación de las placas (tener en cuenta el medio de cultivo con el que se trabajó).

40 Interpretación de los ResultadosEn el medio Agar Lactosa TTC con Tergitol® 7 se consideran pertenecientes al grupo coliforme las colonias naranjas que producen un halo amarillo después de un período de incubación de 24 h a 44°C para coliformes fecales o de 48 h a 37°C para coliformes totales. El período de incubación es 24 h a 44°C para E. coli en los medios Fluorocult y Rapid E coli. En el medio Chromocult la incubación para E. coli se realiza a 37°C durante 24h. En el medio Fluorocult se cuantificarán las colonias con fluorescencia en presencia de luz UV. En el medio Chromocult se enumerarán aquellas colonias con coloración azul violáceo. En el medio Rapid E. coli se cuantificarán aquellas colonias que desarrollen una coloración púrpura. En todos los casos los resultados se expresarán en UFC/100mL.

41 Preguntas y RespuestasMarque las afirmaciones correctas: A través de las aguas contaminadas con residuales se pueden adquirir enfermedades bacterianas, virales y parasitarias. Los coliformes son los organismos indicadores de la calidad de las aguas más ampliamente utilizados. En la práctica los organismos coliformes son mayoritariamente miembros del grupo bacteriano entérico. Generalmente, los coliformes son habitantes del tracto intestinal humano y de animales de sangre caliente. Todos los coliformes provienen de las heces fecales humanas. La ubicación de los coliformes en el grupo se realiza atendiendo a caracteres taxonómicos. Los coliformes son patógenos humanos de gran importancia.

42 Preguntas y RespuestasMarque las afirmaciones correctas: Todas las Enterobacterias son móviles, fermentan la glucosa y producen gas. Todas las Enterobacterias son catalasa positivos y oxidasa negativos y reducen nitratos a nitritos. Las Enterobacterias son cultivadas en medios complejos ya que poseen altos requerimientos nutricionales. Para la identificación de las Enterobacterias las mismas son cultivadas en medios diferenciales que permiten distinguir las colonias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen. Los géneros Escherichia, Salmonella y Shigella agrupan a organismos indicadores de la calidad de las aguas. La Técnica de Fermentación en Tubos Múltiples y la Técnica de Filtración en Membrana son métodos novedosos para la determinación de la calidad de las aguas.

43 Preguntas y RespuestasLos indicadores microbiológicos deben: Estar ausentes en aguas no contaminadas y presentes en aguas contaminadas, cuando la fuente de microorganismos patógenos está presente. Multiplicarse en el ambiente. Estar en igual número que los microorganismos patógenos. Responder a las condiciones de ambiente natural y a los procesos de tratamiento de manera similar que los microorganismos patógenos. Incrementar su número al aumentar el grado de contaminación en el medio. Aplicables a cualquier tipo de agua. Igual tiempo de supervivencia que los patógenos.

44 Bibliografía Brock T. D., Madigan M. T., Martinko J. y Parker J. (1994). Biology of Microorgnisms, Seventh Edition, Prentice Hall Ed., ; Harley J. P. y Prescott L. M. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology, Fith Edition, The McGraw-Hill Companies, Llop A., Valdés-Dapena M.M. y Zuazo J. L. (2001). Microbiología y Parasitología Médicas. Editorial Ciencias Médicas. Tomo I, Manafi, M. (2000). New development in chromogenic and fluorogenic culture media. Inrternational Journal of Food Microbiology 60, Rompré, A., Servais, P., Baudart, J., de Roubin, M.R. & Laurent, P. (2002). Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches. Journal of Microbiological Methods, 49,