1 LAS BACTERIAS COMO PATOGENOSDIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO

2 ¿QUE SON LAS BACTERIAS? Células pro-cariotas

3 Diferencias entre células procariotas y eucariotasCaracterística Procariota Eucariota Núcleo Sin membrana nuclear, Membrana nuclear, cromosoma único circular uno o más pares de cromosomas ADN extracromosómico Puede estar presente en Presente en plásmidos organelas Organelas No contiene Mitocondrias y citoplasmáticas cloroplastos Membrana Sitio de síntesis de componentes Barrera permeable citoplasmática de la pared y del ADN. Barrera selectiva permeable selectiva Pared celular Capa rígida de peptidoglicano No tiene pared de peptidoglicano Esteroles Ausentes Presentes Ribosomas 70 S en el citoplasma 80 S en el REP División Fisión binaria Mitosis Tamaño 0,2 a 10 µm Mayor a 7 µm

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5 Gram-Positive Cell Wall Teichoic acid Membrane Lipoteichoic acid Peptidoglycan Cytoplasmic membrane

6 Gram-Negative Membrana externa Pared celular de mureína Periplasmacitoplasmática Proteína de membrana externa Antígeno somático ¨O¨ Porinas Lípido A Fosfolípidos Lipoproteína Mureína interna

7 Membrana citoplasmáticaBi-capa lipídica, rica en proteínas Unida al cromosoma, participa en: La duplicación del material genético Síntesis y reparación del ADN Síntesis de los polímeros de la pared celular Síntesis de los componentes celulares Contiene el sistema de transporte de electrones (cadena respiratoria) Barrera permeable selectiva a sustancias externas y participa de la excreción de sustancias internas

8 Morfología bacterianacoco cocobacilo bacilo bacilo en forma de clava fusiforme vibrión espirilo

9 Agrupación bacterianadiplococo tetrada cadena (estreptococos) racimo (estafilococos) bacilos en empalizada (Haemophilus) bacilos formando caracteres chinos (Corynebacterium)

10 Fijación de las células sobre portaobjetos Coloración de contraste:Coloración de Gram Fijación de las células sobre portaobjetos Coloración Primaria: Cristal violeta Mordiente: Lugol (Sol. de Yodo) Decoloración: Alcohol - Acetona Coloración de contraste: Safranina o Fucsina Células de color violeta Células incoloras Células de color rojo BACTERIA GRAM POSITIVA BACTERIA GRAM NEGATIVA

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12 Coloración Acido-Resistente de Ziehl-NeelsenBacterias AAR Fijación de las células sobre portaobjetos Coloración Primaria: Fucsina básica Calentar suavemente Decoloración: Alcohol - Acido Coloración de contraste: Azul de metileno Bacterias no AAR

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15 Crecimiento bacterianoMetabolismo - Reacciones de abastecimiento - Biosíntesis - Polimerización  Del ADN: Replicación  Del ARN: Transcripción  Síntesis de las Proteínas: Traducción - Ensamblado Regulación - Control de la actividad enzimática - Control de la expresión génica División celular - Fisión Binaria

16 Genética bacteriana Genoma bacteriano - Replicación - Transcripción- Traducción Plásmidos Transposones - Movilización Bacteriófagos - Lisis - Lisogenia

17 Variación genética Mutación - Espontánea - Cairnsiana - Inducida

18 + Transformación Transducción Conjugación Chromosomal DNA fragmentsfrom donor bacterium Competent recipient Donor DNA uptake Phage contains some bacterial DNA (F+) Recipient (F-) Contact by sex pili Donor DNA transferred on replication Cells separate containing DNA infects another cell; Injects ¨donor¨ DNA Recombination Transformed bacterial cell Transduced Recombinant + Bacteriophage Infects Transformación Transducción Conjugación

19 Clasificación de las bacterias por su comportamiento frente al oxígenoTipo de Bacteria Característica Ejemplos Aerobia Necesitan oxígeno Mycobacterium (estricta) No fermentan tuberculosis Anaerobia Muere con oxígeno, Clostridium (estricta) fermenta y se multiplica perfringens si no hay oxígeno Facultativa Respira con oxígeno, Escherichia coli fermenta si no hay oxígeno Aerotolerante Fermenta con o sin oxígeno Streptococcus pyogenes Microaerofílica Crece mejor con poco Campylobacter oxígeno jejuni

20 Aerobe Anaerobe Facultative Microaerophile

21 Crecimiento bacteriano enMedio de Cultivo Cultivo puro Colonias 1 UFC colonia Densidad de un cultivo Tiempo medio de generación Temperatura óptima - Bacterias psicrófilas - Bacterias mesófilas - Bacterias termófilas

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23 Cultivos a partir de muestras clínicas

24 Aislamiento a partir de una Muestra Clínica

25 Interacción de las bacterias con el húespedFlora Normal - Colonización - Simbiosis - Protección Patógenos Factores de virulencia......Infección......Enfermedad - Adhesinas - Cápsulas - Toxinas - Dosis infectante Patógenos oportunistas - Situación predisponente

26 Flora Normal de las MucosasNariz Corynebacterium spp Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Garganta Streptococcus spp Branhamella catarrhalis Haemophilus spp Neisseria spp Mycoplasma spp Colon Bacteroides fragilis Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Enterobacter spp Klebsiella spp Lactobacillus spp Candida albicans Clostridum spp Genitales masculinos Mycobacterium spp Bacteroides spp Boca Fusobacterium spp Actinomyces spp Leptotrichia spp Veillonella spp Piel Propionibacterium acnes Pityrosporum ovale Vagina Gardnerella vaginalis

27 Acción patógena bacterianaAdherencia - Adhesinas - Fimbrias - Proteínas Locomoción Invasión Sideróforos Producción de Toxinas - Exotoxinas - Endotoxinas Estrategias contra las defensas del huésped - Evasión del complemento - Interferencia de la fagocitosis  Inactivación fago-lisosoma  Resistencia a las enzimas  Inhibición de la oxidación  Escape de la vacuola - Variación antigénica - Destrucción de anticuerpos

28 Mecanismos de Resistencia del HuéspedPrimera Línea de Defensa: Barreras Anatómicas Piel intacta, Cilias, Mucus, Peristaltismo, Reflejos de la tos y deglución, Flujo urinario e intestinal, Flora normal de las Mucosas. Factores fisiológicos pH bajo, Baja tensión de Oxígeno, Inhibidores químicos, Enzimas. Segunda Línea de Defensa: Defensa Humoral Inespecífica Complemento, Lactoferrina, Transferrina Fagocitosis por los PMN y Macrófagos fijos Drenaje Linfático, Inflamación, Fiebre. Defensa Humoral Específica Anticuerpos, Inmunidad celular

29 Infección y Enfermedad- La bacteria accede y se establece Enfermedad - Respuesta del huésped a la infección

30 Interacción huésped-bacteria DINÁMICA ENCUENTRO DISEMINACIÓN DESENLACECuración del paciente Muerte del paciente Portación Reservorio ambiental zoonótico humano ESTABLECIMIENTO MULTIPLICACIÓN PENETRACIÓN DAÑO Signos Síntomas Evasión de Las defensas DINÁMICA Interacción huésped-bacteria

31 Diagnóstico de la infección bacterianaDiagnóstico presuntivo Evaluación Clínica Evaluación epidemiológica

32 DIAGNOSTICO DE LA INFECCION BACTERIANADIAGNOSTICO PRESUNTIVO: Sospecha clinica Anamnesis DIAGNOSTICO ETIOLOGICO: Muestras Clínicas Directo: Aislamiento e Identificación IFD Polisacáridos de cápsula Secuencias de ADN Indirecto: Anticuerpos específicos Variación de Título de AC en muestras pareadas

33 Diagnóstico de la infección bacterianaDiagnóstico de certeza (Diagnóstico bacteriológico) Directo - Aislamiento en cultivo e identificación - Identificación microscópica inequívoca - Presencia de un componente bacteriano específico:  Polisacárido  Acido nucleico Indirecto - Presencia de Anticuerpos específicos - Aumento del Título de Anticuerpos (seroconversión)

34 Cultivo e IdentificaciónMuestra clínica adecuada Toma de muestra correcta Transporte de la muestra - Aerobios - Anaerobios Observación microscópica directa - Examen en fresco - Tinción de Gram - Tinción de Ziehl-Neelsen (AAR) - Tinciones especiales - Inmunofluorescencia directa Cultivo - Medios de enriquecimiento - Medios de aislamiento - Medios de identificación

35 Bacterias patógenas Cocos piogenos Gram positivos- Streptococcus spp: S. pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, etc. - Staphylococcus spp: S. aureus, S. epidermidis, etc.  Gram negativos - Neisseria spp: N. meningitidis, N. gonorrhoeae, etc. - Branhamella catharralis Bacilos gram positivos  Corynebacterium spp  Listeria monocytogenes  Bacillus spp  Clostridium spp, Bacilos anaerobios no-esporulados

36 Bacterias patógenas Bacilos gram negativos  ¨Fastidiosos¨- Haemophilus spp - Brucella spp  Enterobacterias - Oportunistas - Patógenos entéricos  Bacilos gram (-) no fermentadores - Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, etc.  Vibrio spp

37 Bacterias patógenas Actinomycetales Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium. Otros no T.  Nocardia spp, Actinomyces spp Chlamydia spp Micoplasma y Ureaplasma Riquetsias  Bartonella spp  Coxiella burnetti, etc. Espiroquetas  Borrelia  Leptospira  Treponema

38 Huésped con infección bacterianaPERSONAL DE ENFERMERÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Obtención Procesamiento MUESTRAS CLÍNICAS MICROORGANISMOS QUE CAUSAN ENFERMEDAD TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO

39 MUESTRAS CLINICAS PARA ESTUDIO MICROBIOLOGICOMUESTRAS DIRECTAS: Provienen de sitios normalmente estériles Por Punción Por aspiración de Líquidos de Cavidades Biopsias MUESTRAS INDIRECTAS: Muestras emitidas: Contienen el Agente Etiológico y componentes de la Flora Normal Cultivos cuantitativos Cultivos Selectivos

40 CULTIVO DE ORINA RECOLECCION DE LA MUESTRANiños y Adultos que controlan esfinteres: Chorro Medio Mujeres. Higiene de Genitales y Tampón Hombres: Higiene y Retracción del prepucio Niños y Adultos que no controlan esfínteres: Nunca utilizar Bolsitas Colectoras. Al acecho: Cooperación de la Madre o Personal de Enfermería Cateterización con sonda nueva: En Resultados controvertidos Vejiga Neurogénica Punción suprapúbica: Muestra Directa Bacilos G. Negativos: Cualquier Número Cocos G. Positivos: Rto: >100 UFCml

41 CULTIVO DE ORINA RECOLECCION DE LA MUESTRA (Continuación)Enfermos con Sonda vesical Punción proximal de sonda Recolección con sonda estéril en el recambio MUESTRAS DISTINTAS AL CHORRO MEDIO Primer Chorro miccional: Para investigar Chlamydia spp y Mycoplasma-Ureaplasma :solo en casos extremos de no cooperación. Orina para investigar Mycobacterias CONSERVACION DE LA MUESTRA Refrigerar de inmediato: Chorro Medio, Puncion de Sonda, Orina por Cateterismo, Orina para Micobacterias. No Refigerar y Remitir de inmediato: Punción Suprapúbica, Primer Chorro Miccional

42 MUESTRAS DE VIA AEREA SUPERIOREXUDADO DE FAUCES Investigación de S. pyogenes( S.G.A.) Cultivo Investigación de Antigeno de S.G.A. Cultivo de N. gonorrhoeae EXUDADO NASAL Solo para Cultivos de Vigilancia PUNCIÓN-ASPIRACION DE SENOS PARANASALES Y OIDO MEDIO Diagnostico de Sinusitis Otitis Media

43 MUESTRAS DE VIA AEREA INFERIORMUESTRAS NO FBC ESPUTO: Valoración por microscopía Expectoración profunda Esputo inducido ASPIRADO TRAQUEAL: Solo en pacientes donde es peligroso obtener muestra por FBC Cuantificación del Cultivo MINIBAL MUESTRAS POR FBC LAVADO BRONQUIAL: Para Hongos y BAAR BAL: Cuantificación Para Diagnóstico de NAR CEPILLO ENVAINADO BIOPSIA DE PULMON: Muestra Directa

44 HEMOCULTIVO ¿CUÁNDO? Antes de la administración de ATBSEn todo paciente con Fiebre( >38°C) o Hipotermia (<36°C) En presencia de Leucocitosis (PMN >12000mm3) o Leucopenia (PMN< 4000mm3) con desviación a la izquierda Signos diferentes en Edad avanzada y HID Antes del pico febril

45 HEMOCULTIVO ¿COMO? Toma de muestra: Punción venosa Periférica- Preparación de la piel Limpiar la zona con torunda de algodón con alcohol 70° o Yodo-povidona SIN FROTAR. Dejar actuar 1 minuto - Obtención de la muestra: Con Jeringa y aguja Con sistema de Doble punta conectado al Frasco de Hemocultivo Inoculación de los Frascos de Sistema Automatizado Evitar el Reflujo No alterar la Atmósfera del interior del Frasco

46 HEMOCULTIVO ¿CUANTO? VOLUMEN DE SANGRE POR MUESTRA NUMERO DE MUESTRASNeonatos: 0,5 a 1 ml Pediatría: 1 a 5 ml Adultos: 10 ml NUMERO DE MUESTRAS En situaciones no urgentes 2 con intervalo de 1 hora En situaciones de urgencia dos muestras simultaneas de dos venas diferentes: Meningitis Neumonia Aguda Endocarditis y FOD: 2 muestras iniciales con intervalo de 1 hora y si al dia siguiente no hay resultados positivos repetir dos muestras de igual modo

47 ¿QUÉ TIPO DE MEDIOS DE CULTIVO?HEMOCULTIVO ¿QUÉ TIPO DE MEDIOS DE CULTIVO? Para recuperación de Gérmenes Aerobios Para recuperacion de Anaerobios Estrictos Para pacientes que recibieron Antibióticos previos Para investigar Fastidiosos: Brucella spp Estreptococos DN Post Transfusión Para investigar organismos intracelulares: Para Hongos causales de Micosis Profundas Para Micobacterias

48 INFECCIONES ASOCIADAS A CATETERES CENTRALESSI HAY INDICACIÓN DE EXTRACCIÓN DEL CATETER Hemocultivo previo a la extracción del catéter Punta de catéter en tubo estéril seco Eventual Punción-aspiración de flebitis PARA EVALUACIÓN DE CATETERES DE LARGA PERMANENCIA Retrocultivo: Cultivo cuantitativo de un volumen de 10 ml de sangre obtenida a traves del catéter a evaluar: Lo obtiene el médico. Cultivo cuantitativo de igual volumen de sangre de una vena periférica: Lo obtiene el personal de Laboratorio

49 MATERIAL DE HERIDAS Y TEJIDOS BLANDOSCULTIVO CUALITATIVO: Por Punción-Aspiración: Por piel sana Con solución fisiológica estéril en tubo con tapa a rosca Para cultivo de Anaerobios en Frasco TAB Hisopo: Desaconsejable Piezas de Tejido: En tubos estériles con tapa a rosca: Usar un tubo para cada sitio quirúrgico diferente Piezas de más de 1 cc no necesitan conservante CULTIVO CUANTITATIVO: En Frasco Estéril Previamente tapado sin añadir conservante

50 LIQUIDOS DE PUNCION LCR LIQUIDO PERITONEAL LIQUIDO ARTICULARAlícuota para Cultivo en Tubo estéril Investigación de Antígenos solo es redituable en: Parámetros anormales y Antibióticos previos (24 hs.) Sospecha de Meningitis por C. neoformans LIQUIDO PERITONEAL Peritonitis Primaria: en Tubo estéril y Frasco de Hemocultivo Peritonitis Terciaria: en Tubo estéril Dialisis Peritoneal LIQUIDO ARTICULAR Artritis Séptica Infección secundaria a Instrumentación Infección post-Traumatismo Con contaminación exógena Por mordeduras

51 COPROCULTIVO A: Diarrea adquirida en la Comunidad o del ViajeroSalmonella, Shigella, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter, E coli O157 (en Heces con sangre) C. difficile (en ATBS previos) B: Diarrea Nosocomial: > 3 días de internación Buscar sólo Toxina de C. difficile Si Hay Brote de inf. Nosocomial seguir como en A C: Diarrea persistente principalmente en H I D Giardia, Cryptosporidia, Cyclospora, Isospora belli Si es HIV positivo agregar: Microsporidia, Complejo M. avium y además considerar como en A

52 MUESTRAS PARA EL DIAGNOSTICO DE ETSInvestigación de N. gonorrhoeae en: Endocervix, Ex uretral, Secreción prostática, Canal anal, Ex. Fauces, Líquido articular, Hemocultivo, Espermocultivo. Investigación de Chlamydia trachomatis en: Endocervix, Ex uretral, Sec. Prostática, Sec. Conjuntival, Sec. Respiratoria de neonatos Investigación de Mycoplasma y Ureaplasma en : Endocervix (con cuantificación), Ex uretral, Secreción prostática, Líquido peritoneal, Secreción respiratoria de neonatos. Lesiones genitales: Microscopía de Fondo oscuro de la lesión VDRL y FTAbs en sangre

53 MUESTRAS NO APTAS PARA SU PROCESAMIENTOPunta de sonda Foley Orina de Bolsa Colectora Descarga de Colostomía Drenajes o Descarga de drenajes Loquios, Sangre menstrual Hisopado de Heridas o de Escaras Líquidos de punción coagulados Gasas de cirugía Muestras inadecuadas para Cultivo de Anaerobios Estrictos Heces formadas para investigar Agentes de Diarrea o Toxina de C. difficile Uñas

54 MUESTRAS ADECUADAS PARA INVESTIGACIÓN DE ANAEROBIOS ESTRICTOSOrina: Punción Suprapúbica Sangre: Hemocultivo en Frasco Anaerobio Líquidos de Punción y Colecciones Varias: Volumen > 10 ml en tubo estéril Volumen menor en frasco con atmósfera inerte Heridas: Tejido en volumen mayor de 1cc Punción-aspiración por piel sana Muestras Ginecológicas: DIU y Punciones Muestras Respiratorias: Tejido y Punciones Materia fecal: solo para investigar Toxina de C. difficile