1 Leslie Elizabeth Lara RamosUNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA OBTENCIÓN DE UN COCTEL DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS PARA EL CONTROL DE BACTERIOSIS EN CULTIVOS DE TOMATE (Solanum lycopersicum) DEL CANTÓN AMBATO, PROVINCIA DE TUNGURAHUA. PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA Leslie Elizabeth Lara Ramos Noviembre, 2015

2 Introducción Objetivos Materiales y métodos Resultados DiscusiónCONTENIDO Introducción Objetivos Materiales y métodos Resultados Discusión Conclusiones Recomendaciones

3 INTRODUCCIÓN

4 FORMULACIÓN DEL PROBLEMABacteriosis Clavibacter Pseudomonas Xanthomonas Ralstonia 5% - 100% total de cultivos Identificación bacteriana y manifestación Programas de mejoramiento Factores ecológicos y patogénicos  sensibilidad y/o resistencia microorganismos Escasos estudios de biocontrol Microorganismos antagonistas  Trichoderma y Bacillus.

5 JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMAImportancia Fin Alto consumo Reemplazo 2837 ha siembra Producción TM/año (INEC, 2010)

6 INTRODUCCIÓN En Ecuador… Origen:Perú  México  España  resto del mundo Súper productores: China, EE.UU, India, Turquía, Italia, Irán y México (Polanco, 2011). Taxonomía: Lycopersicon esculentum (Miller, 1768) Solanum lycopersicum (Actualidad)

7 Condiciones de CultivoINTRODUCCIÓN Morfología Condiciones de Cultivo Dicotiledónea perenne. Crece de forma rastrera, semierecta o erecta Aproximadamente de 1m altura Bajo invernadero °C Temperatura 65 y 70% de humedad relativa del ambiente Humedad Normal Luminosidad Arenosos o arcilloso con materia orgánica. pH 5,5 - 6,8 Suelo Sistema Radicular Tallo Hojas Flor Fruto

8 INTRODUCCIÓN Enfermedades Cáncer Bacteriano Bacterianas:Fungosas: Antracnosis, Alternariosis, Cenicilla, Fusarium, Moho gris, Mancha gris de la hoja, Moho blanco, Tizón temprano, Tizón tardío, Verticillium. Virales: TYLCV, ToMV, TMV, CMV, PVY, TVSV, TSWV. Cáncer Bacteriano Clavibacter michiganensis Decoloración marrón-rojiza del sistema vascular. Mancha Bacteriana Xanthomonas campestris En hoja manchas cloróticas rodeadas de halo amarillo. Mancha Negra del Tomate Pseudomonas syringae Manchas de color negro en tallo y hoja rodeadas de un halo color amarillo. Marchitez Bacteriana Ralstonia solanacearum Marchitez total.

9 INTRODUCCIÓN BACTERIÓFAGOS Generalidades ClasificaciónFrederick Twort (1915) Felix d’Herelle (1917) “fagein” = comer bacteriófago 1930  Morfología, genética y replicación viral.  Terapia de fagos. 2002 y 2003  Primera fagoterapia para Enterococcus resistentes a vancomicina y S. aureus resistente a meticilicina. orden Caudovirales 96% 60% Siphoviridae 25% Myoviridae o Podoviridae 4% 10 familias restantes (Martins da Silva, 2011)

10 INTRODUCCIÓN Mecanismo de Acción

11 Inocuo para hospedero bacterianoINTRODUCCIÓN Fagoterapia Condición: Infección lítica. (García, 2014) Vida media: 48 hrs 1027 partículas/minuto 1025 bacterias lisadas Inocuo para hospedero bacteriano BACTERIÓFAGOS PLANTAS Pectobacterium carotovorum (Lim, et al., 2013) Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Frampton, y otros, 2014)

12 OBJETIVOS

13 OBJETIVO GENERAL Obtener un coctel de bacteriófagos líticos para el control de bacteriosis en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum) del cantón Ambato, provincia de Tungurahua.

14 OBJETIVOS ESPECÍFICOSAislar y caracterizar, mediante pruebas bioquímicas y moleculares, los agentes causales de bacteriosis en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum) del cantón Ambato, Provincia de Tungurahua. Reproducir los postulados de Koch en plantas sanas de Solanum lycopersicum para comprobar la patogenicidad de las bacterias aisladas. Aislar un coctel de bacteriófagos líticos a partir de suelo agrícola y comprobar su funcionalidad mediante ensayos de doble capa.

15 MATERIALES Y MÉTODOS

16 MATERIALES Y MÉTODOS Zona de Estudio Campo LaboratorioAislamiento Bacteriano Identificación Bioquímica Identificación Molecular Postulados de Koch Obtención Bacteriófagos

17 Aislamiento BacterianoMATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento Bacteriano Corte Siembra: Agar Nutritivo Selección Desinfección: NaClO (1%), Etanol (70%) Colonias aisladas  cultivos puros

18 Identificación Fenotípica y Bioquímica MEDIO DE CULTIVO / REACTIVOMATERIALES Y MÉTODOS Identificación Fenotípica y Bioquímica PRUEBA MEDIO DE CULTIVO / REACTIVO Gram Cristal violeta, lugol, safranina y alcohol acetona Motilidad SIM Fluorescencia King-B Catalasa 1 gota de H2O2 Oxidasa Discos de oxidasa Indol 2 a 3 gotas de reactivo de Kovac H2S Citrato Citrato Simmons Producción de gas Campana de Durham Caldo Glucosa Glucosa Caldo Glucosa (con Rojo Fenol)

19 Identificación Molecular “Wizard® Genomic DNA Purification Kit”MATERIALES Y MÉTODOS Identificación Molecular Extracción de DNA 500 uL / 200 uL buffer TE 1X Proteinasa K 4000 rpm 5 min 100°C 15 min 0°C 5 min Cultivo bacteriano 24 h 4000 rpm 5 min Cuantificación NanoDrop 260/280 = 1.8 – 2 “Wizard® Genomic DNA Purification Kit” Isolating Genomic DNA from Plant Tissue” Planta con sintomatología

20 Identificación Molecular Tamaño del producto (pb)MATERIALES Y MÉTODOS Identificación Molecular Primer Secuencias 5’  3’ Tamaño del producto (pb) Identificación Referencia PsF CTACGGGAGGCAGCAGTGG 150 Género Pseudomonas Región conservada secuencia 16S (Purohit, 2003) PsR TCGGTAACGTCAAAACAGCAAAGT MM5F GAACGAGCTGAAGGAAGACA 527 Pseudomonas syringae pv. tomato Gen hrpZ (Shenge, 2008) MM5R CAGCCTGGTTAGTCTGGTTA Máster Mix GoTaq 1X, H2O ultrapura, Primers (F y R) 0.3uM / 0.4uM Perfil térmico 95°C, 5 min; (94°C, 30 s; 57.5°C, 30 s; 72°C, 30 s) 35 X; 72°C, 5 min 94°C, 5 min; (94°C, 30 s; 58°C, 45 s; 72°C, 1 min) 35 X; 72°C, 5 min Electroforesis Gel agarosa 1,5% PCR

21 MATERIALES Y MÉTODOS Postulados de KochSuspensión bacteriana de 1x107 UFC/ml en agua destilada estéril. Germinación Semillas Curva de crecimiento bacteriano Preparación Inóculo Cada 2 horas, 2 días UFC 𝑚𝐿 = Colonias por caja 10 −x . 𝑣

22 Reaislamiento fitopatógenoMATERIALES Y MÉTODOS Postulados de Koch Inoculación Inyección en tallo Punción en hoja Monitoreo Reaislamiento fitopatógeno Identificación Agar Nutritivo Fenotípica Bioquímica Molecular Plantas 2 meses Nebulización previa

23 Obtención de BacteriófagosMATERIALES Y MÉTODOS Obtención de Bacteriófagos Pre-enriquecimiento 4 gr 7 mL Sobrenadante Filtrado 0,4 y 0,2 um Sobrenadante 25 mL Triptosa (10mMMgSO4) 28°C, 24 h 25 mL Triptosa (10mMMgSO4) 28°C, 48 h 4000 rpm 30 min 4000 rpm 30 min 1 mL CB 24 h 1 mL CB 24 h

24 Obtención de BacteriófagosMATERIALES Y MÉTODOS Obtención de Bacteriófagos Enriquecimiento Control Filtrado CB 24 h 5 mL Filtrado ADE 10 uL c/u FB Sobrenadante FB C CB FB C CB 28°C, 15 h Filtrado 0,4 y 0,2 um 28°C, 24 h 4000 rpm 30 min almacenamiento 4°C oscuridad OD 600 nm OD 600 nm

25 Caracterización de BacteriófagosMATERIALES Y MÉTODOS Caracterización de Bacteriófagos Spot Test Agar Doble Capa Título viral 100uL 900 uL ADE 28°C, 24 h Triptosa 0.4% 100uL dilución fago + 100uL bacteria UFP ml = Número de placas d.v Triptosa 1.5% 50°C

26 Caracterización de BacteriófagosMATERIALES Y MÉTODOS Caracterización de Bacteriófagos Microscopía Electrónica Alícuota de 0,5 uL del filtrado de fagos. Tinción con PTA al 2% a pH 5. Vista al TEM con magnificación

27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

28 RESULTADOS Y DISCUSIÓNAislamiento Bacteriano Origen Tipo de muestra Presencia de Bacteria B Fruto deforme con hundimientos Muestra vegetal Si Agua No Fruto normal con pequeñas costras Tallo joven con mancha oscura Tallo adulto, grueso, con mancha oscura Hoja con mancha oscura 70% Fruto Tallo Hoja

29 RESULTADOS Y DISCUSIÓNIdentificación Fenotípica y Bioquímica (Breed, 1957) Prueba / Característica Bacteria B Color blanco Bordes ligeramente irregular Crecimiento a 37°C - Tinción Gram Morfología bacilo Motilidad + Fluorescencia Catalasa Oxidasa Indol H2S Citrato +/- Producción de gas Glucosa glucosa (+), producción de gas (-) B) indol (-), Motilidad (+), Producción de H2S (-) C) Citrato (+/-) (Ramírez, 2009) Pseudomonas

30 RESULTADOS Y DISCUSIÓNIdentificación Fenotípica y Bioquímica Bacteriosis en tomate Pseudomonas corrugata Pseudomonas syringae P. syringae pv. tomato P. syringae pv. syringae. Bacteria “B” (Guevara, 2008) Fluorescencia positiva Oxidasa negativa Fluorescencia negativa Oxidasa positiva Fluorescencia positiva Oxidasa negativa (Zainsoft, 2015) P. syringae

31 RESULTADOS Y DISCUSIÓNCurva de crecimiento bacteriano 15 h Estado exponencial óptimo

32 RESULTADOS Y DISCUSIÓNPostulados de Koch Hoja Pruebas de patogenicidad Evolución de la sintomatología a los 5 (B), 10 (C) y 15 (D) días (Castilla, 2007) Muestreado “Mancha negra” “Bacterial Speck”

33 Evolución de la sintomatología a los 5 (B), 10 (C) y 15 (D) díasRESULTADOS Y DISCUSIÓN Postulados de Koch Tallo Pruebas de patogenicidad Evolución de la sintomatología a los 5 (B), 10 (C) y 15 (D) días (Castilla, 2007) Muestreados “Mancha negra” “Bacterial Speck”

34 RESULTADOS Y DISCUSIÓNPostulados de Koch Reaislamiento Fenotipo Fluorescencia Agar King -B

35 RESULTADOS Y DISCUSIÓNIdentificación Molecular Muestra Concentración Ácido Nucleico (ng/ul) 260/280 B 532.3 1.80 BH 224.5 2.02 H 520.4 1.83 Género Pseudomonas con el par de primers PsF/PsR Pseudomonas syringae pv. tomato con el par de primers MM5F/MM5R. (B) DNA bacterias aislamiento original, (BH) DNA bacterias re-aisladas de ensayo de patogenicidad, (H) DNA total de plantas infectadas con bacterias, (M) 100pb ladder y (-) control negativo.

36 RESULTADOS Y DISCUSIÓNObtención de Bacteriófagos control filtrados E OD Filtrado Fago OD Control OD reducido Reducción bacteriana (%) 1 0.047 0.277 0.230 79.29 2 0.104 0.224 0.120 53.57 3 0.046 0.167 0.121 64.94 4 0.052 0.111 0.059 53.15 Bacteriófagos funcionales

37 RESULTADOS Y DISCUSIÓNTítulo Viral Dilución Placas/caja UFP/mL 10-1 – 10-4 incontable 10-5 61 61x106 10-6 3 3x107 10-7 – 10-8 - (A) número de placas incontable, (B) número de placas contable, (C) ausencia de placas.

38 RESULTADOS Y DISCUSIÓNTítulo Viral Placas: redondas homogéneas individualizadas 1 – 1.5 mm Vibrio cholerae  1 hasta 9 mm (Talledo, 1998) Salmonella enteritidis y Salmonella infantis  0.5 hasta 7 mm (Quiroz, 2015), “Tamaño de placa es equivalente al alcance de un solo virus en el organismo huésped.” (Dini, 2011)

39 Descripción MorfológicaRESULTADOS Y DISCUSIÓN Descripción Morfológica (Frampton, 2014): Bacteriófagos para Pseudomonas syringae pv. actinidiae. orden Caudovirales familia Myoviridae (Martins da Silva, 2011)

40 CONCLUSIONES El análisis metabólico y molecular señala presencia de Pseudomonas syringae pv. tomato. Corresponde a la enfermedad comúnmente llamada “mancha negra”. La planta mostró síntomas claros de la enfermedad en tallo y hojas a los 15 días de haber entrado en contacto con el microorganismo. La bacteria fitopatógena mantuvo sus características bioquímicas y moleculares después de ser reaislada, cumpliendo de esta manera los postulados de Koch. Coctel de bacteriófagos líticos con título viral de 3x107 UFP/mL, mostró controlar la proliferación bacteriana patogénica tanto en medios líquidos como sólidos. Placas de diámetros de entre 1 y 1.5 mm, homogéneas, circulares definidas y perfectamente individualizadas. Análisis en TEM reveló una misma morfología de fagos, los cuales pertenecen al orden Caudovirales y están dentro de la familia Myoviridae.

41 RECOMENDACIONES Mantener los bacteriófagos en condiciones de oscuridad y bajas temperaturas, durante las manipulaciones para evitar su destrucción. Seguir con los estudios de optimización, mantenimiento y conservación de bacteriófagos a largo plazo. Probar el rango de huéspedes de los bacteriófagos para conocer el alcance del control biológico, especialmente con los demás fitopatógenos bacterianos de Solanum lycopersicum. Realizar estudios de caracterización molecular y purificación de los bacteriófagos, con el fin de desarrollar un producto biotecnológico efectivo. Llevar a cabo ensayos de biocontrol a pequeña, mediana y gran escala en plantas de tomate probando también técnicas de aplicación en los cultivos.

42 AGRADECIMIENTOS

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