1 Lupinus angustifoliusBiblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko

2 Cel pracy Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifoliusCharakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking

3 Materiały DNA Lupinus angustifolius, izolowany z jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej Enzym restrykcyjny HindIII Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre) Komórki kompetentne E. coli DH10B Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG) Płytki do przechowywania klonów w temperaturze -80oC, 384-miejscowe

4 „sortera chromosomów”Detektor Źródło światła Naładowana elektroda Selekcjonująca krople Zanieczyszczenia Frakcja o ładunku dodatnim ujemnym + _ Puls ładujący próbkę Próbka 1. Izolacja DNA za pomocą „sortera chromosomów”

5 2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C) 32. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C) 3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze x TBE) Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120° Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°

6 4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC)5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)

7 Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F) 7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi

8 8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)

9 9. Sprawdzenie średniej długości insertów - trawienie BAC’ów enzymem NotI - elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s, 16h, 6V/cm, kąt 120°)

10 Dystrybucja wielkości insertówProcentowy udział w bibliotece Długość insertu [kbp]

11 - wzór Clarke’a i CarbonaObliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji nukleotydowej genu w bibliotece BAC - wzór Clarke’a i Carbona P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece N - liczba klonów (55 296) x - średnia długość insertu (100 kpz) y - wielkość genomu (920 Mpz)

12 Klucz odczytywania sygnałów10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA łubinu Klucz odczytywania sygnałów Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA Dwa pozytywne sygnały na klony BAC

13 12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD40 12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC

14 Podsumowanie Skonstruowano pierwszą bibliotekę BACdla genomu Lupinus angustifolius Charakterystyka biblioteki: - liczba klonów: - średnia wielkość insertu: 100 kbp - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% - pokrycie: 6x