1 MALDI-TOF MS y Análisis de ProteínasCurso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid- CSIC

2 Oferta del Servicio de ProteómicaAnálisis mediante Espectrometría de Masas Identificación sistemática de proteínas presentes en las bases de datos a partir de geles La Síntesis de Péptidos y la Secuenciación de Edman son servicios independientes

3 Servicio de “Proteómica”Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

4 Equipos disponibles Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex de Bruker, equipado con reflector y sistema para PSD Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una bomba de HPLC Beckman Gold controlada por un ordenador IBM PS2 de 500K de RAM y un restrictor de flujo Accurate de LCPackings Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT regalada por Thermo Finnigan y columna RP de 180 mm

5 Procedimiento de trabajoRecepción y control de muestras Aviso previo a la entrega de geles Escaneo del gel, Confección de ficha de usuario, Asignación de fichero Instrucciones del trabajo a realizar Análisis Digestión manual en gel Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-TOF Análisis mediante LC-ESI-IT (centrado en Proteómica)

6

7 Requisitos para la preparación de geles y digestiónReactivos Manipulación Confección del gel Tinción (Coomassie/Imidazol-Zn, Sypro-Ruby,plata) Digestión en gel Procedimiento adaptado de Mann y cols optimizado para portamuestras de Bruker Control interno de contaminación y eficiencia y externo de eficiencia

8 Identificación mediante PMFTres niveles de preparación de muestras: Sensibilidad normal (Coomassie): método estándar Alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker Muy alta sensibilidad (Coomassie, Sypro-Ruby, Plata): método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (método sin publicar)

9 Identificación mediante PMFMétodos de calibración: “close-external” para búsquedas en DB con ppm mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con ppm interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con ppm Motores de búsqueda: Internet (Mascot, Profound) Motor de desarrollo propio (*) * Campillo, Martín and Vázquez (en preparación)

10 Identificación Proteína Identificación PéptidoProteómica: Péptidos Proteoma BASE DE DATOS Fragmentos BASE DE DATOS Proteína Identificación Péptido

11 ESTRATEGIA INTEGRADORA PARA EL ANÁLISIS DEL PROTEOMASDS-PAGE Digestión “in situ” en paralelo Bandas de proteínas 2D-IEF-SDS-PAGE Extracto de péptidos mapa de péptidos MALDI-TOF Identificación de proteína m-desalado automático aislamiento y fragmentación Secuenciación “de novo” Electrospray-trampa iónica

12 Mapa de péptidos (MALDI-TOF) Extracto crudo digestión “en gel”Intensidad m/z

13 Identificación de la proteína a partir del mapa de péptidos (“peptide-mass fingerprinting”) Búsqueda en MASCOT (D.Pappin, ICRF, Londres) 1. gi| Mass: Score: 87 (M76598) alpha cardiac myosin heavy chain [Mus musculus] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Start End Miss Peptide ANSEVAQWR MFNWMVTR TLEDQANEYR LEAQTRPFDIR NNLLQAELEELR IEELEEELEAER DIDDLELTLAKVEK LQNEIEDLMVDVER ILNPAAIPEGQFIDSR DLEEATLQHEATAAALR HADSVAELGEQIDNLQR MEGDLNEMEIQLSQANR KMEGDLNEMEIQLSQANR LTQESIMDLENDKLQLEEK NDLQLQVQAEQDNLNDAEER ALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTK DTQLQLDDAVHANDDLKENIAIVER No match to:

14 MALDI-TOF: How’s It Work?5.They drift (or fly) down a field free flight tube where they are separated in space. 6. Ions strike the detector at different times, depending on the mass to charge ratio of the ion. 1. Sample is mixed with matrix & dried on sample plate 4. Ions are accelerated by an electrical field to the same kinetic energy el kV Flight tube High vacuum 2. Target is introduced into high vacuum of MS High voltage 3. Sample spot is irradiated with laser, desorbing ions into the gas phase and starting the clock measuring the time of flight. Pulsed laser Time 7. A data system controls all instrument parameters, acquires the signal vs. time, and permits data processing.

15 MALDI-TOF/MS Time-of-Flight Molecular Mass Laser Sample Target ClockDetector Time-of-Flight Molecular Mass

16 MALDI-TOF/MS matrix analyte sample solution dry samplessample deposition insert target and perform analysis

17 Ionización/DesorciónMatrix for Proteins: sinapinic acid, dihydroxybenzoic acid etc. Matrix for Peptides: 4-hydroxy-a-cyanocinnamic acid, DHB. it co-crystallizes, absorbs laser energy, evaporates and acts as acid

18 Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI)+ Cationized analyte Analyte molecules Matrix molecules Laser beam Matrix molecules Matrix ions -explicar -prob choque dos veces con matriz es muy baja: carga 1 -dos características fundamentales: pulsante y carga 1+ -eficiencia depende de razón analito/matriz y forma de cristalización Cortesía de Bruker Daltonics

19 Tres niveles de preparación de muestras:Sensibilidad normal: método estándar. Alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker. Muy alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz DHB y cristalización heterogénea.

20 Preparación de la muestra: anchor-DHB

21 Fundamentos del TOF -todo lo que entra se ve: alta eficiencia detección -potencialmente mucha resolución: depende de fuente de iones -comentar reflector, extracción pulsante

22 MALDI-TOF Linear detector Reflector detector Laser Reflector Source

23 Resolución isotópica

24 Voltaje de extracción

25 Extracción retardada

26 Extracción retardada

27 Decomposition occurs in the flight tubeLinear detector Reflector detector Laser Decay can occur at any point along here Reflector Source

28 Fundamentals of PSD PSD refers to a method of detecting and measuring the masses of fragment ions formed from a selected precursor ion during the flight time. Fragment ions are mainly formed by unimolecular decomposition after the precursor ions are fully accelerated (after they exit the source—hence post-source decay) Fragment ions are separated in the reflector.

29 PSD fragment ion velocities are the same as their precursors+ All three of these species travel at the same velocity in the flight tube until they reach the mirror. + Why? Velocity is determined by initial acceleration. Initial energy = 20 keV. Bond energies = ~ 10 eV, so breaking a bond has a very minor effect on velocities.

30 Neutral fragments are not detectedReflector detector Fragmented precursor ion + + 0 V. +20 kV Reflector

31 Fragment ions take different paths in the reflectorReflector detector Intact precursor ion + + Fragment ion formed by PSD 0 V. +20 kV Reflector

32 PSD ISD