1 Marcadores celulares: radioisótopos, cromóforos, fluoróforos y otrosMétodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

2 Radioisótopos: principios generalesRadioisótopos empleados en biomedicina: 3H, 14C, 13C, 32P, 33P, 35S , 125I, 131I, 24Na 1 dps = 1 Bq; 60 dpm = 1 Bq; 1 mCi = 37 kBq Eficiencia, E = cpm/dpm Técnicas: autoradiografía (histoquímica, electroforesis), centelleo líquido, contaje gamma, trazadores orgánicos (distribución y metabolización).

3 Propiedades de los radioisótopos3H 14C 35S 32P 125I T1/ a* 5730a* 87.4d* 14.3d* 60d* Radiación b b b b g Penetración (aire) 6 mm 24 cm 30 cm 7,2 m > 10 m Escudo No 1 cm 1 cm 1 cm plomo 0.25 mm (13 mm para 131I) Actividad (Bq) 3· ·108 4·109 1·108 1·107 Limite anual (MBq) *a=años, d=días

4 Cromóforos: la absorción

5 Ley de Beer-Lambert I = I0 · 10-e c l Log I0/I = A = e · c · lLa densidad óptica (D.O.) es la absorción en us sistema en el que l = 1

6 Cromóforos

7 Cromóforos: el espectrofotómetro

8 Cromóforos intrínsecosDeterminados grupos prostéticos de proteínas actúan como cromóforos intrínsecos. Su espectro característico sirve para identificar proteínas.

9 Cromóforos intrínsecos

10 Fluoróforos: excitación y emisiónLa molécula A es fluorescente, mientras B carece de fluorescencia. G denota el estado basal; S el primer estado excitado.

11 Esquema del fluorímetro (Formato en L)Prisma o filtro

12 Fluoróforos: ejemplos

13 Fluoróforos: Ejemplos

14 Ejemplo en microscopia de fluorescenciaMedición con Fura-2 de la concentración de Ca2+ en célula de Purkinje.

15 Fluoróforos: Marcaje Marcaje de proteínas con anticuerpos fluorescentes. Ejemplo de marcaje con anticuerpos primarios y secundarios

16 Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica ampliamente utilizada para separar, clasificar, analizar e investigar las células

17 Fluorescencia en la fluidez de membranaFluidez y difusión mediante FRAP (Fluorescence Recovery After Fotobleaching)

18 Fluorescencia e Interacción entre moléculas (FRET)FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

19 Fluorescencia en la fluidez de membranaEstudio de la fluidez en híbridos ratón-humano Patching y capping en membranas de leucocitos

20 Otros métodos de marcajeOro coloidal Biotina-Avidina Marcaje enzimático Esferas magnéticas Marcaje de Spin

21 Fluorescencia en la fluidez de membranaEJERCICIO: Describe un experimento en el que uno de los siguientes marcajes sea una buena elección: Marcaje de una proteína con 125I. Marcaje de una hormona con 3H.