1 Mecanismos de interacción entre la proteína M2-1 del Virus Respiratorio Sincicial Humano con ARN Introducción Ivana G. Molina*, Sebastián A. Esperante, Lucía B. Chemes y Gonzalo de Prat Gay Laboratorio de Estructura-Función e Ingeniería de Proteínas, Fundación Instituto Leloir, IIBBA- CONICET. Argentina. * [email protected] La infección por el Virus Respiratorio Sincicial Humano es la principal causa de enfermedad severa del tracto respiratorio inferior en niños e infantes. A pesar del conocimiento acumulado acerca del virus, no se cuenta con una vacuna ni antivirales eficientes contra el mismo. El complejo polimerasa es clave para su ciclo biológico, se encarga de la replicación del genoma, la transcripción y las modificaciones post-transcripcionales. Comprende ARN unido a la nucleocápside N y las proteínas P, L, y M2-1 (Figura 1). La proteína M2-1 es un tetrámero de 194 aminoácidos (Figura 2); tiene función de antiterminador de la transcripción, y de factor elongador aumentando la procesividad de la polimerasa, para lo cual necesita unirse al ARN. Se sabe que M2-1 reconoce ARNs de distinta naturaleza a través de su región “core” (Figura 2.B), pero se desconoce su especificidad. La proteína P también interactúa con M2-1 a través de la región “core” con alta afinidad para reclutarla al complejo polimerasa. El presente trabajo plantea el estudio de los mecanismos de interacción entre la proteína M2-1 tanto en su versión completa como de la variante monomérica M2-1 Core (Figura 2C), con ARN de distintas longitudes marcados con isotiocianato de fluoresceína (Figura 3) y el efecto de la proteína P sobre la estabilidad de estos complejos. Resultados P M2-1 ARN COMPLEJO M2-1: ARN COMPLEJO M2-1: P M2-1 ARN 15nt FITC RNA 25nM Cubeta 1x1 cm P r0= 0.045 r final Core ~ 0.08 (MW M21 + RNA) ~ 25 Kda r final Full ~ 0.17 (MW 4M21+2RNA) ~ 100KDa Conclusiones 2) Mecanismo de interacción M2-1:ARN 3) Cinética de la asociación M2-1:ARN 4) Estudio del rol de la proteína P sobre la estabilidad del complejo 5) Interacción M2-1 core:ARN y rol de la proteína P sobre la estabilidad del complejo Figura 5: A) Curva de titulación seguido por fluorescencia con 400 nM de ARN FITC y concentraciones crecientes de M2- 1. B) Ensayo de cambio en la corrida electroforética (EMSA) : concentraciones crecientes de M2-1 fueron incubadas con 200 nM de ARN FITC 20 nucleótidos y sembrado en gel para observar cambio de movilidad cuando hay formación de complejo. C) Curva de titulación con 25 nM de ARN 20 nucleótidos y concentraciones crecientes de M2-1 seguido por anisotropía. D) Curva de titulación con 100 nM de ARN 10 nucleótidos y concentraciones crecientes de M2-1 seguido por anisotropía. Las titulaciones fueron realizadas en buffer 50 mM Tris.Cl pH 7.5, ClNa 0.1 M a 20 °C. Figura 6: Cinética de asociación normalizada 25 nM ARN FITC 15 nucleótidos, agregando M2-1 y midiendo la fluorescencia en el tiempo. Figura 7: Ensayos de competencia con la proteína P. A) Luego de titular ARN FITC 20 nucletidos con M2-1, se procedió al agregado de P para observar si hay desplazamiento de ARN del complejo. Este experimento se realizó en buffer 50 mM Tris.Cl pH 7.5, ClNa 0.1 M a 20 °C. B) Ajuste de datos a una curva biexponencial para obtener constantes observadas de velocidad de salida de ARN del complejo. Se estudió el tiempo en el cual se llega al equilibrio en la formación de complejo M2-1:ARN. Figura 8: Curva de asociación con 400 nM de ARN FITC 15 nucleótidos, titulando con M2-1 core, luego se procedió al agregado de la proteína P para observar si hay desplazamiento de ARN del complejo. Los ensayos fueron realizados en buffer 50 mM Tris.Cl pH 7.5, ClNa 0.1 M a 20 °C seguido por anisotropía. Tabla 1: Constantes de disociación (KD) de las dos variantes de M2-1 con ARN y con la proteína P. La afinidad de M2-1 por ARN aumenta a mayor longitud de este último. Los 3 oligonucleótidos se unen a la proteína, pero lo hacen con distinta afinidad, eso se puede observar en el corrimiento de las transiciones. La unión ARN-proteína es de alta afinidad (KD~25 nM) y es un proceso altamente cooperativo con una estequiometría de unión 2:1 (dos moléculas de ARN por tetrámero) para oligonucleótidos de 15 y 20. No se observa cooperatividad en la unión M2-1:ARN para oligonucleótidos de 10. Figura 1: Esquema del complejo polimerasa del Virus Respiratorio Sincicial Humano. A) 10 nt AGUUGAGUUG 15 nt AGUUGAGUUGAGUUG 20 nt AGUUGAGUUGAGUUGAGUUG Figura 3: Esquema de los oligonucleótidos sintéticos marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), en el extremo 5’, los cuales se utilizaron para realizar los experimentos de asociación con M2-1. Su secuencia esta compuesta por un grupo de nucleótidos AGUUG repetidos 2, 3 o 4 veces. ARN-FITC Q 73 194 B)B) M2-1 TETRÁMERO 22.3 KDa M2-1 MONÓMERO 13.6 KDa Figura 2: (A) Modelo de cinta de la estructura cristalina del tetrámero M2-1 de hRSV. (B) Monómero de M2-1, se muestran sus regiones con distintos colores: dominio de unión a zinc (naranja); hélice de tetramerización (magenta); núcleo o “core” (azul); hélice flexible (gris); extremos N y C etiquetados con esferas azules y rojas, respectivamente. (C) Secuencia de M2-1 (194 aminoácidos) donde se indica el sitio de corte con la enzima quimiotripsina (residuo 73), para generar la variante monomérica (121 aminoácidos). C) Tanner et al. (2013) doi: 10.1073/pnas.1317262111 1) Afinidad de M2-1 por ARN Se realizaron titulaciones al equilibrio utilizando ARN de distintas longitudes marcados con FITC, titulando con la proteína M2-1 tetramérica pura. Se compararon las diferencias en las transiciones de acuerdo a la longitud del oligonucleótido. Figura 4: Curva de asociación 25 nM de ARN FITC de 10, 15 y 20 nucleótidos con M2-1, seguido por fluorescencia. Los ensayos fueron realizados en fluorímetro Jasco en buffer 50 mM Tris.Cl pH 7.5, ClNa 0.1 M a 20 °C agregando concentraciones crecientes de M2-1 a una concentración fija de ARN. 10 nt15 nt20 nt Afinidad 20nt > 15nt >> 10nt Afinidad 20nt > 15nt >> 10nt ESTEQUIOMETRÍA COOPERATIVIDAD A) 0 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2 4.8 6.4 9.6 12.8 0 0.08 0.16 0.32 0.48 0.64 0.96 1.3 1.9 2.5 [M2-1] uM M2- 1:AR N B)B) C) D) A) B)B) Tabla 1 2:1 M2-1[M2-1:2RNA]RNA Estudiando la cinética de unión M2-1:ARN se observó una fase lenta de asociación que llega al equilibrio a los 5 minutos, sugiriendo la presencia de rearreglos lentos en el complejo. La proteína P produce desplazamiento efectivo del ácido nucléico del complejo M2-1:ARN, es decir P compite con el ARN por la unión a M2-1 sugiriendo una superposición de los sitios de contacto. M2-1 core forma complejo con ARN con una menor afinidad (KD~1.3 uM) que M2-1:ARN. La proteína P produce desplazamiento de ARN del complejo. La afinidad de M2-1 tanto por P como por ARN se encuentra aumentada 30 a 50 veces en el tetrámero M2-1 con respecto al monómero M2-1 Core. M2-1 P P +++ DESPLAZAMIENTO BINDING PP + + + Referencias Bibliográficas Esperante SA et al. DOI: 10.1021/bi300765c. Biochemistry, 2012, 51 (41), pp 8100–8110. Tanner SJ et al. (2013) DOI: 10.1073/pnas.1317262111. vol. 111 no. 4, pp 1580–1585.