1 Medición de actividad enzimática: CálculosDra. Sobeida Sánchez Nieto

2 Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasaLa reducción del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.

3 Desarrollo experimentalAmortiguador de fosfatos pH 7.0 Piruvato de sodio NADH Diluciones apropiadas de enzima. Esto quiere decir: pH constante [Sustratos] constante [E] variable A [s] alta

4 La actividad de una enzima tiene unidades de velocidad.m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min : es el coeficiente de extinción molecular para el NADH que es 6220 M-1 cm-1 (es decir 6220 L mol-1cm-1 que también es igual a 6220mLmmol-1cm-1). b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo (1mL).

5 Como hicieron diluciones entoncesF= factor de dilución Enz= volumen de la enzima dado en mL

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8 Tabla de purificación de proteínas

9 Para determinar los parámetros cinéticosUsar los datos de actividad enzimática a diferentes concentraciones de sustrato

10 La actividad de una enzima tiene unidades de velocidad.m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min : es el coeficiente de extinción molecular para el NADH que es 6220 M-1 cm-1 (es decir 6220 L mol-1cm-1 que también es igual a 6220mLmmol-1cm-1). b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo (1mL) Proteína: la que pusieron en el ensayo dado en mg.

11 Cómo calcular cuanta proteína pusieronEjemplo: Si su concentración de proteína es de 10 µg/µl y usaron de está 5 µl de una dilución 1:50. Entonces A. Al diluir la fracción 1:50 la concentración queda 10 µg/µl = 0.2 µg/µl 50 B. Por lo que al tomar 5 µl del diluido 0.2 µg/µl * 5 µl = 1 µg C. Entonces en el ensayo pusieron 1 µg que es igual que mg proteína

12 Concentración de proteínas de las fraccionesFRACCIÓN Concentración (µg/µl) Fracción 1 14.96 Fracción 2 11.244 Fracción 3 54.81 Fracción 4 11.51 FP Afinidad1 0.4 FP Afinidad2 0.5 FP Afinidad3 0.3 FP Intercam1 0.02 FP Intercam2 FP Intercam3