1 METODOLOGÍA DE ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN HEREDITARIADra. Adriana Mimbacas

2 CITOGENETICA HISTORIA CRONOLOGIA

3 1866: Mendel describe las unidades fundamentales de la herencia1925: se descubre que la actividad del gen está relacionada con su posición en el cromosoma. 1953: se propone la estructura en doble hélice del ADN 1956: Tijo y col.: Nº real de cromosomas = 46 1959: Lejeune y col. describieron la primera aberración cromosómica numérica (síndrome de Down)

4 inclusión en parafina y cortes con micrótomo,METODOS DE ESTUDIOS inclusión en parafina y cortes con micrótomo, técnica de aplastado cultivo celulares "in vitro".

5 Existen múltiples factores que inciden en la obtención exitosa de un cultivo:esterilidad, medios de cultivos apropiados y sus aditivos, dispositivos apropiados para el cultivo, temperatura, pH, tensión del gas.

6 CULTIVOS IN VITRO Permiten obtener células en el estadio de metafases en la división mitótica

7 MORFOLOGÍA DE LOS CROMOSOMAS METAFÁSICOSSe observan diferentes regiones: estrechamientos o constricciones. Primarias Secundarias

8 CONSTRICCION PRIMARIAHUMANOS: Centrómero localizado Centrómero difuso: holocéntrico (ej: insectos, arácnidos primitivos).

9 CONSTRICCIONES SECUNDARIAS:Estrechamientos constantes en posición y tamaño. En ciertos casos están íntimamente relacionadas al organizador nucleolar (evidenciadas por hibridización "in situ" con ARN ribosomal)

10 SATELITES (grupo D humano).segmento cromosómico presente entre el organizador nucleolar y el telómero (grupo D humano).

11 CONSTANTES CROMOSOMICASCaracterizan a una especie. Se evidencian fundamentalmente en metafase. Las más importantes son:

12 número cromosómico el complemento somático diploide (2n) del ser humano es 46 formado por el aporte haploide de cada gameto (23 cr=n) (n23+n23=2n46).

13 tamaño cromosómico característico de cada especie.Se tiene en cuenta la longitud relativa con respecto a la suma de la longitud de un conjunto cromosómico haploide

14 morfología cromosómicaPresentan 2 brazos cromosómicos Brazo corto: p Brazo largo: q Se clasifican de acuerdo a la posición del centrómero en: Metacéntricos Submetacéntricos Acrocéntricos Telocéntricos (no existen en el hombre)

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16 Morfología cromosómicaCENTROMERO BRAZO LARGO BRAZO CORTO METACENTRICO CENTROMERO CENTRAL SUBMETACENTRICO BRAZOS DESIGUALES ACROCENTRICO CENTROMERO EN POSICION SUBTERMINAL (UN BRAZO MUY CORTO)

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18 CARIOTIPO Es un arreglo sistematizado de los cromosomas de una célula la cual es fotografiada y ordenada de acuerdo a las normas establecidas (tamaño, morfología). Es característico de un individuo y no cambia.

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20 BANDEO G: Bandas transversales claras y oscuras . Localización fija, Su nombre se debe a que la tinción se realiza con Giemsa Corresponden a: genes de replicación tardía ricas en AT (oscuras) Genes de replicación temprana ricas en GC (claras)

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24 1 2 3

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27 IDIOGRAMA: Es la representación en forma de diagrama del cariotipo y su construcción se realiza en base a valores promedios.

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29 Los métodos de obtención e bandas cromosómicas son variados y pueden agruparse en:métodos salinos, enzimáticos (tripsina, pronasa), técnicas varias en las que se incluyen sustancias como urea, permanganato de potasio).

30 Bandeo G: Es el bandeo que se utiliza en la nomenclatura de los cariotipos

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32 NOMENCLATURA Sigue ciertas normas establecidas por convenciónNúmero de cromosomas seguidos de una coma cromosomas sexuales, seguidos de una coma alteraciones encontradas: del = delección t = translocación ins = inserción I = isocromosoma r = anillo Seguidos de paréntesis cromosoma involucrado(s), bandas afectadas

33 ejemplos mujer normal: 46, XX hombre normal 46, XYmujer con alteración numérica: 45, XX, -8 hombre con alteración estructural: 46, XY, t(8,14) mujer con alteración estructural: 46, XX, del(9p12)

34 ALTERACIONES DEL COMPLEMENTO CROMOSOMICOEl complemento cromosómico puede experimentar variaciones debido a: modificaciones en el número de los cromosomas que lo constituyen: alteraciones numéricas Modificaciones en la estructura de los cromosomas: alteraciones estructurales

35 ANOMALIAS NUMERICAS HETEROPLOIDIA: cualquier alteración en el número normal del cariotipo 1. HAPLOIDIA: 1 sólo juego crom. (monoploide) 2. POLIPLOIDIA: aumento por duplicación del complemento cromosómico entero (poliploide) 3. ANEUPLOIDIA: organismos o células que tienen uno o más cromosomas que el número básico de la especie.

36 Aneuploidía Monosomías: ausencia de un cromosoma del par de homólogos = 2n - 1 (viable 45 X0) Trisomías: presencia de más de un cromosoma en el par de homólogos = 2n +1 (producen abortos aunque existen algunas que son viables con diferente grado de sobrevida: tri 21, tri 13, tri 18, 47XXY) Mosaicos: coexistencia de células normales y alteradas

37 Anomalias numéricas

38 Síndrome de Down 47, XX, + 21

39 Síndrome de Patau: 47,XX, + 13

40 Síndrome de Edwards: 47, XY, +18

41 Síndrome de Turner 45, X0

42 Mujer tri-X: 47, XXX

43 Síndrome de Klinefelter: 47, XXY

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45 ANOMALIAS ESTRUCTURALES

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47 ALTERACIONES ESTRUCTURALESLos cambios de la estructura cromosómica pueden ser agrupados en dos grandes categorías: cromáticas cuando afectan a una sola de las cromátidas y cromosómicas cuando afectan a ambas cromátidas en el mismo punto.

48 cambios submicroscópicos:mutación génica o puntual cambios microscópicos: afectan el número y/o el arreglo de los loci de los genes pérdida de un segmento aumento de un segmento reordenamiento intracromosómico reordenamiento intercromosómico

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52 DELECION

53 Cri du Chat: 46, XX, del (5p14)

54 ISOCROMOSOMAS MECANISMO NORMAL

55 INVERSION fracturas con giro de 180º del fragmento intersticial.En el hombre las inversiones más frecuentes son las que afecta las regiones heterocromatínicas del 1, 9, 16 pueden no causar alteraciones en el individuo, pero pueden provocan alteraciones en la descendencia.

56 Se clasifican en: SIMPLES: un sólo segmento invertido y según su relación al centrómero pueden ser: - pericéntrica: si el fragmento involucra el centrómero - paracéntrica: si no lo involucra

57 COMPLEJAS: se invierten simultáneamente varios segmentos de un mismo cromosoma

58 SI LA INVERSION OCURRE EN LOS PRECURSORES DE LOS GAMETOS PUEDE PRODUCIR GENOMAS ANORMALES EN LA PROGRESION A TRAVES DE LA MEIOSIS. LA RECOMBINACION ENTRE HOMOLOGOS EN EL CUAL UNO DE ELLOS TENGA UNA INVERSION Y EL OTRO NO PUEDE RESULTAR EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS

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60 CROMOSOMA EN ANILLO

61 DUPLICACION

62 TRANS. NO BALANCEADA

63 TRANS. BALANCEADA

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65 Anormalidades Cromosómicas Amniocentesis en Población General3.3 4.0 2.4 71.9 53.9 24.0 18.5 22.1 N = amniocentesis; anormalidades (1.64%)

66 Anormalidades Cromosómicas Población de Edad Materna Avanzada1.9 1.2 3.5 78.5 63.6 14.8 19.4 17.0 N= amniocentesis; anormalidades (2.08%)

67 APLICACION DEL ANALISIS CITOGENETICOEstudios en: sangre periférica líquido amniótico Vellosidades coriales Sangre o tejidos neoplásicos

68 TÉCNICAS PARA DETECTAR CAMBIOS SUBMICROSCOPICOSTécnicas moleculares

69 HIBRIDIZACION IN SITU Fue originalmente descripta en 1969 utilizando sondas marcadas con 32P radioactivo (Gall y Pardue, 1969).

70 SONDA: fragmento de ADN que es “marcado “ con métodos radioactivos o por inmuno-histoquímicaEstas sondas se unen a su ADN complementario localizado en cromosomas fijados en un portaobjeto

71 DEFINICION La hibridización "in situ" es una detección directa de ácidos nucleícos en el material celular en el cual se puede realizar a la vez, un análisis morfológico. (Herrington y McGee, 1994)

72 APLICACIONES Rápida identificación de cromosomas humanos específicos en híbridos celulares somáticos Identificación de cromosomas marcadores en metafases cromosómicas Mapeo de genes en la investigación del genoma.

73 Búsqueda de aberraciones cromosómicas en estudios de dosimetría de radiación.Identificación de cambios cromosómicos

74 Estas sondas se obtienen de genotecas de ADN recombinante producidos a partir de cromosomas específicos aislados por medio de un clasificador celular y clonados en vectores (fago lambda o plásmido pBR) Se marcan con fluoroforos

75 WHOLE CHROMOSOME PAINTINGUtiliza como sonda fragmentos que contienen secuencias homólogas de ADN a lo largo de todo un cromosoma

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77 Sonda Dual Color DiGeorge/VCFS TUPLE 1Deleción del 22q11.23 Sonda Dual Color DiGeorge/VCFS TUPLE 1

78 Microdeleción Prader-Willi / Angelman Sonda LSI SNRPN/ CEP 15/ PMLFISH detecta la deleción de la región 15q11-13.

79 Traslocación del SRY al XpMezcla de sondas: LSI SRY SpectrumOrange – región delecionada CEP X SpectrumGreen – sonda control

80 DUPLICACION

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82 APLICACIONES Rápida identificación de cromosomas humanos específicos en híbridos celulares somáticos Identificación de cromosomas marcadores en metafases cromosómicas Mapeo de genes en la investigación del genoma. Búsqueda de aberraciones cromosómicas en estudios de dosimetría de radiación. Identificación de cambios cromosómicos

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84 GENOMA DEFINICIÓN 1920: set de cromosomas de una célula haploide de un organismo. 1970: suma total de genes. (no se conocía aún la existencia secuencias no codificantes). Hoy: es un sistema estructural, funcional y evolutivo. (Es mucho más que la suma de sus partes: regiones codificantes 3% del total y no codificantes).

85 Un marcador “genético” es una característica genética discreta y segregante que caracteriza a una población por virtud de su presencia, ausencia, alta o baja frecuencia (Crawford, 1973). Marcador genético: corresponde a un lugar específico en el genoma con segregación demostrable y de confiable determinación que presenta variación (polimorfismo) en las poblaciones.

86 ASPECTOS CITOGENTICOS Y MOLECULARES DE TUMORES

87 Las diferencias cruciales entre células normales y células cancerosas se encuentran en los cambios discretos que se producen en genes específicos que controlan la proliferación y homeostasis tisular Esos genes cuando son activados conducen a una proliferación celular desregulada.

88 Existen tres tipos de cambios que ocurren cuando una célula comienza la tumorogénesisInmortalización: crecimiento indefinido Transformación: describe los fallos que se observan en el crecimiento normal Metástasis: capacidad de las células tumorales de invadir otros tejidos

89 Existen dos clases de genes en los cuales las mutaciones pueden inducir la transformaciónONCOGENES GENES SUPRESORES DE TUMOR

90 ONCOGENES Inicialmente identificados como genes portados por virus que causan transformación en las células blanco La mayoría de los oncogenes virales tiene su contrapartida celular involucrada en funciones normales de la célula (protoncogenes)

91 Son genes dominantes, (protooncogenes) que en el genoma normal, codifican proteínas, las cuales funcionan como: factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento, señales de traducción de proteínas proteínas nucleares involucradas en regulación transcripcional.

92 La generación de un oncogen representa una ganancia de función en la cual un protooncogen celular está inapropiadamente activado. Esto puede involucrar: un cambio mutacional en la proteína, o activación constitutiva, sobre-expresión o falla en el apagado de la expresión en el tiempo adecuado.

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94 La activación de oncogenes, actuando en forma dominante, es un paso importante en la cascada de eventos que finalmente conducen al desarrollo de un cáncer invasivo La transformación puede ocurrir: espontáneamente o puede ser causada por la infección de ciertos virus tumorales.

95 VIRUS ONCOGENICOS

96 Poliomas (ADN) la región temprana del virus utiliza splicing alternativos para sintetizar proteínas (T-antígenos) que son requeridos para la expresión de la región tardía y para la replicación del ADN viral. Se integran al genoma de la célula huésped produciendo transformación Los virus humanos equivalentes al SV40 y al polioma son los virus BK y JC. El BK puede transformar células en cultivo pero no se ha asociado a ningún cáncer humano en concreto.

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98 Papiloma (ADN) HPV, Provoca tumores epiteliales generalmente benignos pero también se asocian a cánceres cervicales (E6, E7) Las proteínas producidas inmortalizan las células blanco

99 Adenovirus (ADN) Comprende un gran grupo de virus relacionadosEn humanos generalmente se asocia a enfermedades respiratorias Las células transformadas ganan una parte de la región temprana del virus que contienen los gene E1A y E1B que codifican para proteínas nucleares. Ej: Epstein bar virus: carcinomas nasofaringeo

100 Retrovirus (ARN) La transformación mediante retrovirus es más complejo que la de los virus a ADN Su ciclo de vida básico no incluye proteínas con actividad transformante.

101 ELEMENTOS GENETICOS DEL PROVIRUS Y DE LOS PRODUCTOS GENICOS DEL VIRUS

102 ESQUEMA DEL CICLO DE VIDA DE UN RETROVIRUS

103 Ciclo de vida 2 moléculas de ARN unidas por enlaces no covalentesCada molécula tiene un ARNt unido Cada virión contiene alrededor de 50 moléculas de transcriptasa inversa En el citoplasma la transcripción inversa utiliza el ARNt como cebador para iniciar la síntesis de ADN

104 MECANISMO DE TRANSCRIPCION INVERSA

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106 Después de la transformación, el transcripto inverso migra hacia el núcleo donde se circulariza y se integra al genoma del huésped

107 INTEGRACIÓN DE UNA MOLÉCULA DE ADN CIRCULAR DEL RETROVIRUS

108 El ADN integrado (provírico) se convierte en el molde para la síntesis de ARNLas secuencias de promotor e intensificador y las señales de poliadenilación están en el LTR Ambas LTR poseen secuencias idénticas pero la 5’ promueve la transcripción y la 3’especifica el sitio del poli(A)

109 1a evidencia de virus transductores:virus de sarcoma de Rous contiene secuencias de nucleótidos que no se encuentran en retrovirus muy relacionados pero no transformantes (secuencia src) Esta secuencia fue encontrada luego en los vertebrados en el ADN normal Un gen que es capaz de producir transformación celular puede surgir de un gen celular Por lo tanto la inducción del cáncer puede implicar la acción de genes normales

110 Los oncogenes se denominan con letras cursivas scrEl gen en un retrovirus se indica con el prefijo v (v-scr) El equivalente en el gen celular normal o proto-oncogen se indica con el prefijo c (c-scr)

111 Los retrovirus transductores surgen como resultado de reordenamientos complejos después de la integración del retrovirus cerca de un protoncogen celular La actividad transformante es proporcionada por la información genética celular adquirida, los elementos genéticos que permiten que los oncogenes se expresen y se transfieran de cél en cél se hereda del retrovirus madre

112 ¿Cómo un protooncogen se convierte en oncogen?Cuando un gen celular normal se convierte en un oncogen de un retrovirus se altera significativamente Existen 3 tipos de alteraciones las que pueden afectar a la región de codificación del gen o la expresión del mismo

113 1) un oncogen de un retrovirus es transcripto en cantidades más elevadas y en una gama diferente de células que su protooncogen normal 2) pérdida de parte de los genes celulares; la eliminación de segmentos podría desrregluar la actividad de una proteína que, expresada a altos niveles transformaría células 3) mutaciones puntuales deferencian protooncogenes celulares de oncogenes

114 CONSECUENCIAS DE LAS ALTERACIONESA) Cambio cuantitativo a nivel de la proteína codificada B) Cambio cualitativo de la proteína en si misma

115 RETROVIRUS HUMANOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA (VIH): destruyen los linfocitos T HEPATITIS C VIRUS DE LA LEUCEMIA DE LAS CELULAS T HUMANAS (HTLV):su infección se asocia a un tumor linfocítico-T

116 Los eventos tumorogénicos pueden ser también causados por:Mutaciones Translocaciones Amplificación Todas involucran un proto-oncogen

117 MUTACIONES: ej. c-ras Variantes oncogénicas de c-ras son encontradas en varios tumores primarios. Los protoncogenes c-ras se transforman en oncogénicos por una única mutación, las mutaciones observadas en varios tumores humanos es causado por una sustitución de un aa, (posición 12 o 61) en una de las proteínas Ras

118 EXPERIMENTOS “IN VITRO”Si se sustituye “in vitro” la glicina de la posición 12 por otro aa excepto prolina, el gen c-ras mutado transforma las células cultivadas (los diferentes aa cambian la capacidad transformante) En la posición 61 (ocupada por glutamina) crea un gen con actividad transformante (ác. glutámico y prolina no afectan)

119 COMO FUNCIONA? La proteína Ras es una unión monomérica del nucleótido guanina que se activa cuando se une a GTP y es inactiva cuando se une al GDP. RAS GTP FORMA ACTIVA RAS GDP FORMA INACTIVA

120 Proteína GAP estimula la capacidad de Ras para hidrolizar GTP, convirtiendo a Ras de activa a inactiva. GAP RAS GTP HIDROLISA RAS GDP SE INACTIVA RAS

121 Proteínas GNRF estimulan el reemplazo de GDP por GTP, reactivando a la proteínaRAS GDP RAS GTP SE ACTIVA RAS

122 Una activación constitutiva de Ras puede ser causada por una mutación lo que hace que Ras sea refractario a la interacción con GAP. La incapacidad de hidrolizar GTP causa que Ras permanezca en una forma activada permanentemente

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124 TRANSLOCACIONES La ubicación en un nuevo cromosoma puede activar un oncogen Se descubrió mediante la conección entre los loci que codifican Ig y la ocurrencia de ciertos tumores (desde linfocitos B no diferenciados).

125 En el hombre, la translocación en los tumores de células B involucra al crom. 8 (portador de c-myc) y el cr. 14 (portador del locus IgH) (10%) o crom. 2 (locus kappa) o crom 22 (locus lambda). En los tumores a células T involucra al 8 y al 14 (locus TcR a)

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127 Cuando el c-myc está translocado con el locus Ig, el nivel de expresión está aumentadoPor qué se activa? A) se altere la estructura de c-myc B) en la nueva posición hay genes muy activos La sobreexpresión de c-myc apagaría el proceso de diferenciación de los linfocitos

128 En algunos casos la translocación genera un gen híbrido en el cual la unidad de transcripción activa cambia: los exones de un gen se conectan con los de otro gen. Ejemplo: cromosoma filadelfia (Ph1) presente en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC)

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130 AMPLIFICACIONES Secuencias endógenas pueden ser producidas por amplificación de una secuencia existente. (Generalmente son rearreglos en tandem) Un gen contenido dentro de los repetidos en tandem no necesariamente es expresado por todas las copias pero su expresión tiende a aumentar con el número de copias. Son provocados por resistencia a ciertos agentes Ej: c-myc, c-abl, c-myb, c-erbB, c-k-ras, mdm2

131 Estos tandem pueden existir en en dos formas dentro de la célula.UNIDAD EXTRACROMOSOMICA se hereda en forma irregular UNIDAD INTEGRADA AL GENOMA

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133 En las líneas estables las amplificaciones pueden ser vistas a nivel cromosómico en forma de regiones de tinción homogénea (HSR= homogeneously staining region) En líneas inestables los elementos adicionales también pueden ser observados y se comprueba mediante tinción con Hoechst

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135 Doble diminutos

136 GENES SUPRESORES

137 La pérdida o inactivación de ciertos genes pueden también ser importantes pasos en el camino que conduce a cánceres invasivos. Su función normal es suprimir la proliferación celular, funcionan como barreras fisiológicas en contra de la expansión clonal. Son "genes recesivos" : deben ocurrir mutaciones o deleciones en ambos alelos antes de que la transformación celular ocurra.

138 La pérdida de la función de los genes supresores puede ocurrir por el daño provocado al genoma a través de

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140 RETINOBLASTOMA Es un enfermedad infantil que involucra un tumor de retina Puede ocurrir con una forma heredable o en forma esporádica Está asociado con delecciones en la banda q14 del cromosoma 13 (13q14)

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142 La pérdida de RB está involucrada en otras formas de cáncerEj: osteosarcomas y cáncer pulmonar a células pequeñas RB es una fosfoproteína nuclear que tiene influencia en el ciclo celular Durante G0/G1 del ciclo celular RB no está fosforilado. Durante el ciclo RB es fosforilado por el complejo cdk/ciclina (final de G1) Se desfosforila durante la mitosis

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144 La forma no-fosforilada de RB específicamente se une a varias proteínas (ocurre sólo durante parte del ciclo: fase S) La fosforilación suelta las proteínas las cuales están accesibles nuevamente Estas proteínas incluyen el grupo E2F de los factores de transcripción, los cuales activan genes blanco cuyos productos son esenciales para la fase S

145 Su unión con RB inhibe la capacidad de E2F de activar la transcripción:RB indirectamente evita la entrada en fase S El complejo RB-E2Fdirectamente reprime algunos genes blanco, su discociación permite que ello se expresen. Ciertos antigenos tumorales virales se unen especificamente a la forma no fosforilada de RB

146 Antioncogen p53 Múltiples cánceres humanos muestran ausencia de la proteína p53 o mutaciones en el gen Mapea en el brazo corto del cromosoma 17 (17p13). La proteína p53 codificada por este gen es una fosfoproteína nuclear de 53 kd

147 Ha sido relacionada con:el control del ciclo celular, la reparación y síntesis del ADN, la diferenciación celular la muerte celular programada

148 la proteína p53 normal regula la transcripción a través de uniones secuencia-específicas con el ADN mientras que mutaciones en el gen anulan esta actividad de activación en trans resultando una proliferación celular no controlada

149 la proteína p53 induciría la transcripción de diferentes genes que presenten una secuencia de ADN específica en la región reguladora corriente arriba ("upstream"). Ejemplos: Onc. mdm-2 (murine double minute), gen creatin-kinasa del músculo y el GADD45 (growth arrest DNA damage inducible) gen bcl-2

150 El efecto de la proteína p53 sobre la transcripción de un gen puede estar influenciado por :modificaciones en el gen en si mismo, modificaciones post-transcripcionales (como fosforilación) interacciones con otras proteínas tanto celulares como virales

151 Normalmente, cuando existe un daño en el ADN se activa el p53Dependiendo del estadio en que se produzca el daño existen 2 caminos 1) temprano: activa la maquinaria que previene la futura propagación del daño hasta que éste es reparado 2) tarde: p53 dispara los mecanismos de apoptosis

152 irradiación

153 Interacción de genes supresores de tumor en el ciclo celular

154 Cd4,6 p16 Cdc2 G0 Ciclina D Ciclina A,B p27 p53 cdk2 p21 ciclinaE

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158 CITOGENETICA

159 origen clonal por lo menos dos células contienen la misma aberración cromosómica se utiliza para la nomenclatura el cariotipo compuesto "composite karyotype" (ISCN).

160 Ejemplo: 58-68,XX(p+)Y,-1x3,i(1p), i(1q),+2,-3,del(3)(q21),-4,+5,del(5)(q31),-8,-9,del(9)(q22), -11,del(11)(q14),-12,-13, -14x2,-15,-17x2, ins(17;3)(p13;q21q29), i(17q)x2,-19, -21,-22x2,m2 [cp12].

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