1 Métodos para contar célulasHemocitómetro Basados en la microscopía Tinción de cultivos en monocapa Medidores de la resistencia Métodos para contar células Electrónicos Análisis de imagen Citómetro de flujo Peso Métodos aproximados Contenido de ADN Contenido de proteínas Métodos para contar células

2 El hemocitómetro o cámara de Neubauer

3 La cuadrícula del hemocitómetro1 mm Profundidad = 0,1 mm (rojo) (verde) (gris) (amarillo) (azul) La cuadrícula del hemocitómetro

4 Se introduce la suspensión de células en el hemocitómetro

5 La región de recuento del hemocitómetro

6 La cámara de recuento del hemocitómetro

7 Recuento de células con el hemocitómetro

8 Observación con microscopio óptico y recuento de células

9 Diferencias entre células vivas y muertasDe las tres líneas, la del centro es la que corresponde al límite del cuadrado Célula muerta Célula viva Diferencias entre células vivas y muertas

10 Tinción de cultivos en monocapa

11 Hay tres tipos de contadores electrónicos

12 Funcionamiento del contador de células electrónico (1)

13 Funcionamiento del contador de células electrónico (2)

14 Hay que establecer el rango de tamaños a medirEs importante poner límites a los tamaños (diámetro celular) que se van a medir. El límite inferior elimina el ruido electrónico y los residuos celulares. El límite superior se pone en 30 micras o en infinito. 7,6 – 50 mm Hay que establecer el rango de tamaños a medir

15 El contador distingue las células muertas

16 Con este contador no hay que marcar las células

17 Recuento mediante análisis de imagen

18 Fundamento del recuento de células por análisis de imagen

19 Recuento de células por análisis de imagen

20 Esquema del análisis de la imagen

21 Recuento de células mediante citometría de flujo

22 La difracción de luz frontal permite contar las células y, a la vez, nos da información sobre su tamaño. Citometría de flujo

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24 Estimación del número de células a partir del peso

25 Estimación del número de células a partir contenido proteico

26 Método de Bradford: fundamento

27 Método de Bradford: protocolo

28 Estimación del número de células a partir contenido de ADN

29 Determinación de ADN por la fluorescencia del H33258

30 Estimación del ADN por la absorbancia en el ultravioleta

31 Comparación de los diversos métodos para contar células

32 Métodos para determinar la viabilidad de las célulasExclusión del azul tripán Marcaje fluorescente con naranja de acridina y ioduro de propidio Métodos para determinar la viabilidad de las células Síntesis de novo de proteínas Incorporación de 3H-timidina al ADN Métodos para determinar la viabilidad de las células

33 Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

34 Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

35 Células vivas Células muertasNaranja de acridina: atraviesa la membrana celular y tiñe los ácidos nucleicos, generando una intensa fluorescencia de color verde a bajas concentraciones. Ioduro de propidio: no atraviesa la membrana de células intactas, pero sí la de las células dañadas. Se une a los ácidos nucleicos, desplazando al naranja de acridina y genera una intensa fluorescencia de color rojo. Células muertas Viabilidad celular: Naranja de acridina + Ioduro de propidio

36 Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de proteínas

37 Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de ADN