1 Métodos para contar célulasHemocitómetro Incorporación de colorantes fluorescentes Basados en la microscopía Tinción de cultivos en monocapa Medidores de la resistencia Métodos para contar células Citometría de flujo Electrónicos Análisis de imagen Peso Aproximados Contenido de ADN Contenido de proteínas Métodos para contar células

2 El hemocitómetro o cámara de Neubauer

3 La cuadrícula del hemocitómetro1 mm Profundidad = 0,1 mm (rojo) (verde) (gris) (amarillo) (azul) La cuadrícula del hemocitómetro

4 Se introduce la suspensión de células en el hemocitómetro

5 La región de recuento del hemocitómetro

6 La cámara de recuento del hemocitómetro

7 Recuento de células con el hemocitómetro

8 Observación con microscopio óptico y recuento de células

9 Diferencias entre células vivas y muertasDe las tres líneas, la del centro es la que corresponde al límite del cuadrado Célula muerta Célula viva Diferencias entre células vivas y muertas

10 Tinción de cultivos en monocapa

11 Hay tres tipos de contadores electrónicos

12 Contador de células electrónico (CASY)

13 Resultados del recuento de célulasEs importante poner límites (inferior y superior) a los tamaños que se miden Resultados del recuento de células

14 Recuento mediante análisis de imagen

15 Fundamento del recuento de células por análisis de imagen

16 Recuento de células por análisis de imagen

17 Esquema del análisis de la imagen

18 Citometría de flujo

19 La difracción de luz frontal permite contar las células y, a la vez, nos da información sobre su tamaño. Citometría de flujo

20 Estimación del número de células a partir del peso

21 Estimación del número de células a partir contenido proteico

22 Método de Bradford: fundamento

23 Método de Bradford: protocolo

24 Estimación del número de células a partir contenido de ADN

25 Determinación de ADN por la fluorescencia del H33258

26 Estimación del ADN por la absorbancia en el ultravioleta

27 Comparación de los diversos métodos para contar células

28 Métodos para determinar la viabilidad de las célulasExclusión del azul tripán Marcaje fluorescente con naranja de acridina y ioduro de propidio Métodos para determinar la viabilidad de las células Síntesis de novo de proteínas Incorporación de 3H-timidina al ADN Métodos para determinar la viabilidad de las células

29 Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

30 Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

31 Células vivas Células muertasNaranja de acridina: atraviesa la membrana celular y tiñe los ácidos nucleicos, generando una intensa fluorescencia de color verde a bajas concentraciones. Ioduro de propidio: no atraviesa la membrana de células intactas, pero sí la de las células dañadas. Se une a los ácidos nucleicos, desplazando al naranja de acridina y genera una intensa fluorescencia de color rojo. Células muertas Viabilidad celular: Naranja de acridina + Ioduro de propidio

32 Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de proteínas

33 Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de ADN