1 Métodos para la Identificación MicrobianaBioq. Federico Nicola CEMIC Sub-Comisión de Antimicrobianos (SADEBAC)
2 Comunicación TransporteRol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola Comunicación Transporte
3 Laboratorio (Química clínica)Rol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola Laboratorio (Química clínica) Laboratorio de Microbiología
4 Nuevas tecnologías aplicadas a la microbiología clínicaRol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola Nuevas tecnologías aplicadas a la microbiología clínica Métodos rápidos para la detección de antígenos Sistemas miniaturizados para identificación y sensibilidad Medios de cultivo cromogénicos Equipos automatizados para hemocultivos Sistemas automatizados para identificación y sensibilidad PCR Real-time PCR Microarrays Secuenciación
5 Medios de Cultivo Base Enriquecido De Enriquecimiento DiferencialSelectivo Selectivo y Diferencial Cromogénicos
6 Metodología utilizada para la Identificación microbianaFenotípicos Manuales Galerías Multi-pruebas Automatizados Serológicos Moleculares Ribotipificación Secuenciación Pirosecuenciación Proteómica
7 Métodos Fenotípicos Morfología celular y características de las colonias Pruebas inmediatas (segundos a pocos minutos) Pruebas rápidas (hasta 4-6 hs) Pruebas lentas (18-48 hs) Pruebas de inhibición o sensibilidad
8 Métodos Fenotípicos En el proceso de identificación bacteriana tradicional, la experiencia del microbiólogo es fundamental para la elección de una prueba o una batería de pruebas de forma secuencial, en función de la fiabilidad de las mismas, del género o de la especie bacteriana que se pretende identificar, del origen del aislado bacteriano, así como del costo de las mismas. Los laboratorios deben elaborar y realizar un proceso de identificación normalizado en su actividad diaria, que utilice de forma secuencial o simultánea un conjunto de pruebas cuyo propósito final sea la identificación del microorganismo a nivel de género y especie y que incluya la mayoría de las bacterias desde el punto de vista infeccioso.
9 Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – BioqCurso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy Algoritmo inicial para la identificación de Bacilos gram-Negativos No Fermentadores (BNNF) Oxidasa INICIO Movilidad Glucosa O.F. 1 5 Ox+ Mov+ Oxidan Glucosa Ox - Mov – 2 4 3 Ox+ Mov+ NO Oxidan Glucosa Ox - Mov+ Oxidan Glucosa Ox+ Mov -
10 Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – BioqCurso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy Identificación de BNNF del Grupo 1 (Oxidasa + / Movilidad + / Oxidan Glucosa) 1 Roseomonas spp. Methylobacterium spp. Shewanella spp. + Pig. rosado P. aeruginosa SH2 + (TSI) Pigm. verde + Oxidasa + Movilidad + Glucosa + (oxida) - Sub-Grupo A Fluorescencia P. aeruginosa P. fluorescens P. putida - Colistin Pig. amarillo R S Sphingomonas Agrobacterium “gpo. amarillo” Pseudomonas spp. y otras bacterias infrecuentes Ps ONPG + Lisina + complejo Burkholderia cepacia Lisina - Achromobacter xylosoxidans sbsp. xylosoxidans Maltosa - ONPG - Xilosa + Bu Arginina - Esculina - Nitrato +
11 Ps - - -/+ - - -+ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -+ -Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy Ps Identificación de BNNF – Pseudomonas spp. (Movilidad +) Hidrólisis de (oxidación) Glucosa Fluorescencia Crecimiento a 42ºC Pigmento verde Acetamida Oxidasa Arginina Gelatina Nitrato Almidón Esculina P. aeruginosa + + +/- +- + + + +/- + - - -/+ P. fluorescens + + + - + - + -+ - - P. putida + + +- - - + - - - - - + + - - - +/- - + P. stutzeri + - - - - - - - P. mendocina + + + + + - P. alcaligenes + - - - +/- -+ - - - - - + -+ P. pseudoalcaligenes - - + +/- +- - - - - - + - - +/- +/- + +- - - P. luteola + - - - - -/+ -/+ P. oryzihabitans + -+ - - -
12 FUNDAMENTOS DE LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICALa identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la comparación de las características fenotípicas de bacterias desconocidas con aquellas de cultivos tipo. La fiabilidad de la identificación está en proporción directa al número de características similares. En Microbiología Clínica, la experiencia y asociación entre el microorganismo y el sitio y tipo de infección es de gran ayuda en la identificación preliminar.
13 Galerías Multi-PruebasAPI (bioMérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems (Microgen), etc. Video DEMO API Video DEMO Enterotube Video DEMO Rapid ID
14 Sistemas comerciales automatizadosTarjetas multipruebas cuya inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado. También hay paneles en los que, además de los sustratos para las pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la identificación y antibiograma del microorganismo MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc. Video Demo Vitek 2
15 Métodos Moleculares
16 Hibridación Fluorescente in situ (FISH)Figure 1. Diagram of a molecular beacon. The hairpin structure contains a fluorescent signal molecule on one end and a signal quencher on the other end. If the probe comes into contact with a PCR product with a complementary nucleic acid sequence, the probe opens up and binds to the PCR product, thus separating the fluorescence-reported dye from the quencher, which results in a measurable fluorescent signal.
17 Hibridación Fluorescente in situ (FISH)S aureus PNA FISH: sobre muestras de hemocultivos, usa hibridizaciòn in situ frente a S aureus 16 S rRNA. S:100, E:99.4, VPP:99.4 y VPN:100% Gonzalez Padilla E y col, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23, 396-8, 2004 Takaashi M et al, , 2007 Utilización de PNA FISH para detectar S aureus directo sobre muestras de hemocultivos fue asociado con reducción de mortalidad (8 vs 17%) ,reducción de días cama y costos Tam Ly et al, Therap Clin Risk Man, 4(3), , 28 Detecciòn ràpida de ESBL en K pneumoniae usando hibridizaciòn in situ . TAT: 1 hora Palasubramaian S et al, J Microbiol Methods, 72, 107-9, 2008
18 DNA Microarrays (Microchips)
19 DNA Microarrays (Microchips)MiniVideo
20 Aplicaciones de Microarrays en Microbiología ClínicaMicrobial Detection and Identification human intestinal bacterial pathogens in human fecal samples identification of respiratory pathogens rapid diagnosis of bloodstream infections to identify pathogenic yeasts and molds Antimicrobial Resistance MRSA detection of M. tuberculosis strains resistant to rifampin, isoniazid, kanamycin, streptomycin, pyrazinamide, and ethambutol HIV-1 antiretroviral-drug-resistant profiles
21 PCR – PCR Múltiple Tsalik E et al, JCM, 48: 26-33, 2010Multiplex permitió identificar 24 organismos adicionales Hemocultivo detectó más bacterias que PCR Ambas técnicas se complementan Tsalik E et al, JCM, 48: 26-33, 2010 Carver y col estudiaron el impacto clínico de la detección del gen mecA directo del cultivo (24 hs antes) en pacientes con bacteriemias por S aureus en dos fases. 64 pac MSSA y 103 con MRSA tratamiento adecuado tardío se asoció a mayor mortalidad relacionada a infección y días cama. Carver P et al , JCM, 46, , 2008 Ruimy et al usando triplex PCR directo sobre hemocultivos diferencia S. aureus de SCN y detecta gen mecA evita uso de glucopéptidos en 33% de los pacientes. Ruimy R et al, JCM, 46, , 2008
22 PCR en Tiempo Real La PCR en tiempo real permite detectar los microorganismos que provocan alrededor de un 90% de las bacteriemias Pfaller, M.A., et al. Diagn Microbiol Infect Dis 1999;33: Kolleff, M.H., et al. Chest (1999); 115: Video Demo LightCycler Roche
23 Secuenciación ARNr 16S Marcador housekeeping presente en todas las bacterias. Familia de multigenes u operones cuya función no se modifica con el tiempo, con un alto grado de conservación, y actúa como un marcador eficiente de evolución (cronómetro molecular ). Posee regiones altamente conservadas (primers) y regiones variables especie-específicas. Tamaño adecuado para realizar el análisis de la secuencia de sus bases. Proporciona información útil y rápida sobre identificación y filogenia mediante la comparación con bases de datos públicas (GenBank) que contienen un amplio número de secuencias bacterianas (más de 2 millones !!).
24 Secuenciación Otros genes utilizadosARNr 16S-23S (ITS = espacio intergénico) ARNr 23S rpoB (subunidad β de la ARN polimerasa) gyrB (subunidad β de la ADN girasa) Hps65 (micobacterias) recA (genovariedades de B. cepacia complex) hsp60 (bacterias, arqueas y eucariotas)
25 Recomendaciones Cepas a SecuenciarCepas con escasa descripción Cepas con baja frecuencia de aislamiento Cepas con fenotipos atípicos Cepas de difícil identificación fenotípica Cepas de crecimiento lento o fastidioso Nuevos patógenos Bacterias de difícil cultivo
26 Pirosecuenciación Figure 2. Schematic diagram of a pyrosequencing reaction, in which light is emitted as each specific base is incorporated into the growing DNA sequence. The light signals are translated into sequence data. ATP, adenosine triphosphate; (d)XMP, deoxynucleotic monophosphate; dXTP, deoxyxanthine triphosphate; PPi, inorganic pyrophosphate.
27 Pirosecuenciación
28 Video Demo Secuenciador GenomaMetagenómica Study diversity in environmental microbial communities using the GS FLX and GS Junior Systems. 454 Sequencing Systems have become the standard for ribosomal RNA identification (i.e. 16S, 18S, etc.) and whole genome surveys having enabled an unprecedented view of microbial diversity in such environments as the human gut and mouth, soil, coral reefs, deep sea thermal vents, drinking water, and much more. The clonal reads provided by 454 Sequencing Systems enable population characterization without laborious cloning protocols. Analyze the relative abundance of microbial species under varying environmental conditions Discover new genes and make functional predictions in unculturable species Perform gene expression analysis and functional annotation within microbial communities Identify novel pathogens in viral outbreaks by sequencing fragments of amplified RNA from infected individuals Take advantage of the long read lengths to generate the most accurate representation of samples Video Demo Secuenciador 454 Roche Video Demo Secuenciador Genoma
29 Proteómica La proteómica es el estudio y caracterización del conjunto de proteínas expresadas por un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el estudio de este conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la electroforesis y en la espectrometría de masas MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) La espectrometría de masas es una técnica analítica que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos al permitir la medición de iones derivados de moléculas separándolos en función de su relación masa/carga (m/z) Se basan en la detección de proteínas ribosómicas S y L (2.000 a Da). Se asume que el 80-90% de las señales del espectro de la bacteria son proteínas ribosomales.
30 MALDI-TOF Video Demo MALDI-TOF – La muestra debe estar embebida en una matriz orgánica. – Como fuente de ionización emplea un láser. – La separación de los iones se produce según el «tiempo de vuelo». – El tiempo de obtención del espectro es aproximadamente de un Minuto Las características principales de estos sistemas son las siguientes: - Sin procedimiento previo de extracción => Se utiliza directamente una colonia bacteriana. – Comparan perfil o huella espectral desconocida frente a las de bacterias conocidas => Comparación de espectros generados con bases de datos previas. – Rapidez de la técnica (aproximadamente 90 microorganismos/hora). – Identificación a nivel de género y especie, en ocasiones subespecies.
31 Laboratorio de Microbiología
32 So….. Keep smart Up grade your lab if you can Never forget to update yourself
33 Muchas Gracias