1 Metody badań strukturalnych w biotechnologiiWykład VII Spektroskopia elektronowa (UV-Vis) Spektroskopia CD

2

3

4 Przejście elektronów w cząsteczce ze stanu podstawowego do wzbudzonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej. Widma UV-Vis są zatem widmami elektronowo-rotacyjno-oscylacyjnymi i dlatego jest to dobre narzędzie do badania struktury cząsteczki

5 Spektroskopia elektronowa znajduje zastosowanie:Identyfikacja związków organicznych, Badanie struktury kompleksów tworzonych przez metale przejściowe, Badania kinetyczne (np. równowagi kwasowo/zasadowe i wykrywanie pośrednich produktów reakcji)

6 Zakres widzialny 380nm < violet < 450nm455nm < blue < 485nm 500nm < green < 550nm 570nm < yellow < 590nm 625 nm < red

7

8 Schemat spektrofotometru UV-Vis

9 Przejście σ→σ*

10 Przejście π→π*

11 Przejście n→π*

12

13 Widmo elektronowe Absorbance. Absorbance Długość fali , podawana w nanometerach (nm) 0.0 400 800 1.0 200 maxdla charakterystycznej  UV Visible

14 Rozpuszczalniki stosowane w spektroskopii UV-VisWoda 205 CH3CN 210 C6H Eter 210 EtOH 210 Heksan 210 MeOH 210 Dioksan 220 THF 220 CH2Cl2 235 CHCl3 245 CCl4 265 Benzen 280 Aceton 300

15 Zależność między transmittancją a absorbancjąTransmitancja: T = P/P0 P0 P Absorbancja: A = -log T = log P0/P B (długość drogi optycznej) Zależność między transmittancją a absorbancją

16 Parametry charakteryzujące widmo elektronowe to intensywność absorpcji promieniowania, a w szczególności molowy współczynnik absorpcji ε, określony przez prawo Lamberta-Beera: A = εbc gdzie: A – absorbancja, b – grubość kuwety (cm), c – stężenie molowe roztworu

17 Dlaczego zastosowanie prawa Lamberta-Beera wymaga użyciaabsorbancji zamiast transmitancji? Prawo przestaje mieć zastosowanie wraz ze wzrostem stężenia

18 Podstawowe pojęcia w spektroskopii UV-Vis:chromofor Grupa odpowiedzialna za absorpcje i tym samym za nadawanie barwy (np C=C, C=O) auksochrom Grupa, ktora przyłączona do chromoforu zmienia intensywność i położenie pasma absorpcji (np -OH, -Cl) Przesunięcie batochromłowe Przesunięcie pasma w kierunku mniejszych częstości (większych długości fali) Przesunięcie hipsochromowe Przesunięcie pasma w kierunku większych częstości (mniejszych długości fali)

19 Efekt hiperchromowy Zwiększenie intensywności pasma pod wpływem podstawnika, rozpuszczalnika czy oddziaływania Efekt hipochromowy Zmniejszenie intensywności pasma pod wpływem podstawnika, rozpuszczalnika lub oddziaływania

20 Podobne struktury mają zbliżone widma elektronowe:λmax = 238nm λmax = 240nm λmax = 173nm

21 σ→σ* nm π→π* nm n→σ* nm π→π* nm n→σ* nm n→π* nm

22 Azulen λmax (nm) = 696 ε = 150

23 Pasma absorpcji odpowiadające przejściom π→π*

24 Widma elektronowe peptydu w zależności od jego konformacji w roztworze:1 – α-helisa, 2 – konformacja nieuporządkowana, 3 –β-zgięcie

25 Zastosowanie przejscia π→πZastosowanie przejscia π→π* (Soret band) w badaniach strukturalnych porfiryn

26 Orbitale d w polu o symetrii oktaedrycznej

27

28 CD (Circular Dichroism) – spektroskopia dichroizmu kołowegoMetoda badania budowy przestrzennej związków chiralnych przy użyciu światła spolaryzowanego Warunkiem niezbędnym do wykonania eksperymentu jest absorpcja promieniowania i występowanie centrum chiralności w badanym układzie.

29 Δε = εL - εR Niejednakowa absorpcja prawego i lewego, kołowospolaryzowanego promieniowania nazywa się dichroizmem kołowym. Miarą jego wielkości Jest współczynnik Δε, który wyraża różnicę współczynników molowych absorpcji lewego i prawego, kołowo spolaryzowanego promieniowania: Δε = εL - εR

30 Zastosowania spektroskopii CD:badania konformacyjne peptydów i białek, badanie geometrii układów koodrynacyjnych

31 Zależność pomiędzy typem konformacji, a kształtem widm CD dla peptydów i białek antiparallel b-sheet b-turn a-helix other

32 Różne białka dają różne widma CD – jest to efekt równowagi pomiędzy chymotrypsin lysozyme triosephosphate isomerase myoglobin Różne białka dają różne widma CD – jest to efekt równowagi pomiędzy różnymi formami konformacyjnymi helix 78 52 36 10 sheet 14 9 34 turn 12 11 32 20 other 23 protein myo TIM lys chym percent content

33 Zmiany obserwowane na widmie CD pozwalają śledzić różne procesy np. denaturację peptydów i białek 21ºC : a nice a-helical signal 81ºC : a coil-like signal